Page 18 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

第 ３ 期 张扬 等: １ 种简单快速高效的双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建方法 １ ３

A : p RC３ 和 p RC６b 载 体 示 意 图; B : BsaⅠ 线 性 化 p RC３ 和 p RC６b , M 表 示 DNA 分 子 标 记; C : BsaⅠ 识 别 位 点 和 切 割 位 点 示 意 图;
D 、 E : p RC３ 和 p RC６b转化 DB３．１ 和 Trans１ＧT１ 效果图; F : p GLU６a 载体示意图; G : BsaⅠ 酶切 p GLU６a 获 得 g RNA２ＧLacZＧP U６a , M 表 示
DNA 分子标记; H : p GLU６a上的 LacZ 报告基因使大肠杆菌显蓝效果. A : Dia g ramof p RC３andp RC６b．B : A g aroseg elanal y sisoflinearＧ
izedp RC３andp RC６bb yBsaⅠ , M : Marker．C : Identificationandcleava g esiteofBsaⅠ．D , E : p RC３andp RC６baretransformedintoDB３．１
andTrans１ＧT１．F : Dia g ramof p GLU６a．G : A g aroseg elanal y sisof p GLU６adi g estedwithBsaⅠ , theexo g enousfra g mentisg RNA２ＧLacZＧ
P U６a , M : Marker．H : Theblueclonoiesofre p orter g eneLacZinp GLU６a．
图 １ 双靶点 CRPSPR / Cas９ 载体
Fi g ．１ DualＧtar g etCRPSPR / Cas９vectors

最后用 T ４ DNA 连接酶将 ２ 个靶点 DNA 小片 １０ μ L 反 应 体 系 ( １ μ L１０×NEB T ４ DNA Li g ase
段和 g RNA２ＧLacZＧP U６a 连接到线性化的载体 p RC３ Buffer , ４０ U T ４ DNA Li g ase ), 利用 PCR 仪 １０ ℃
或 p RC６b上, 即可转化大肠杆菌感受态细胞, 涂布 ５min 、 ２０℃ ５ min , 反应 ５ 个循环, 然后将两管 １０
含有卡那霉素、 IPTG 和 XＧ g al的筛选培养基, 挑选 μ L 反应产物混合在一起, 利用 PCR 仪１０℃５min 、
蓝色单菌落测序验证, 即完成双靶点 CRISPR / Cas９ ２０℃ ５min , 反应 １０~１５ 个循环.方法 ２ : 先将靶
载体构建( 图 ２B ). 点 １ 、 靶点 ２ 与外源片段 g RNA２ＧLacZＧP U６a 室温连
2.3 高效连接体系的建立 接３０min , 然后加入线性化的 p RC３ , 总共 ２０ μ L 反
为了 获 得 高 效 的 连 接 体 系, 以 水 稻 基 因 OsＧ 应体系( ２ μ L１０ × NEB T ４ DNA Li g aseBuffer ,
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PGL１ 为例, 设计 ２ 对靶点引物( 表 ２ ), 比较了 ４ ８０U T ４ DNA Li g ase ), 利用 PCR 仪 １０℃ ５ min ,
种不 同 靶 点、 RNA２ＧLacZＧP U６a 和 载 体 浓 度 组 合 ２０℃ ５min , 反应１０~１５ 个循环.方法３ : 将靶点１ 、
g
( 表 ５ ) 在以下 ３ 种连接方法下的连接效率.方法 １ : 靶点２ 、 外源片段 g RNA２ＧLacZＧP U６a 和线性化的 p RC３
先分 成 两 管 反 应, 将 靶 点 １ 与 外 源 片 段 g RNA２Ｇ 直接混合在一起, 总共 ２０ μ L 反应体系( ２ μ L１０×
LacZＧP U６a 连接, 靶点 ２ 与 线 性 化 的 p RC３ 连 接, 各 NEBT ４ DNALi g aseBuffer , ８０UT ４ DNALi g ase ), 利