Page 19 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

华 中 农 业 大 学 学 报 第 ３９ 卷
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A : 靶点设计示意图.如果靶点 １ 的第 １ 个碱基是 A , 则在正向靶点引物的 ５′ 端加 GGC , 如果靶点 １ 的第 １ 个碱基是 G , 则在正向靶点引
物的 ５′ 端加 GTT , 反向靶点引物的 ５′ 端都是加 AAAC ; 第 ２ 个靶点正向靶点引物的 ５′ 端加 GCC , ３′ 端加 GTTTT , 反向靶点引物的 ５′ 端加
CTCTAAAAC . B , C : 载体构建流程图. ２ 对设计好的靶点引物分别变性退火后, 与 g RNA２ＧLacZＧP U６a 一起连入 BsaⅠ 线性化的 p RC３ 或

p RC６b , 即可转化大肠杆菌感受态细胞. A : Dia g ramoftar g etdesi g n．Ifthefirstbaseoftar g et１isA , addGGCtothe５′endoftheforward
tar g et p rimer．Ifthefirstbaseoftar g et１isG , addGTTtothe５′endoftheforwardtar g et p rimer．AddAAACtothe５′endofthereverse
tar g etp rimer．Forthetar g et２ , addGCCtothe５′endandGTTTTtothe３′endoftheforwardtar g et p rimer．AddCTCTAAAACtothe５′
endofthereversetar g et p rimer．B , C : Flowchartforvectorconstruction．Afterdenaturin g andannealin g , twotar g etsto g etherwithg RNA２Ｇ
LacZＧP U６awereconstructedintothelinearizedp RC３ ( B ) or p RC６b ( C ) withT ４DNALi g ase , thentransferredintoE．colicom p etentcells．
图 ２ 双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建流程图
Fi g ．２ FlowchartforthedualＧtar g etCRISPR / Cas９vectorconstruction
g
表 ５ 靶点、 RNA２ＧLacZＧP U６a 和载体组合 用 PCR 仪１０℃５min , ２０℃５min , 反应１０~１５ 个
Table５ Concentrationoftar g ets , g RNA２ＧLacZＧ 循环.
P U６aandp RC３indifferent g rou p s 统计 ４ 种组合在 ３ 种不同连接方法下的蓝白斑
组合 靶点 １ / L 靶点 ２ / L g RNA２ＧLacZＧ 数目( 表 ６ ), 比较蓝斑数量, 方法 ３ 最多, 方法 ２ 次
μ
μ
p RC３ / n g
Grou p s Tar g et１ Tar g et２ P U６a / n g
之, 方法 １ 最少.在 方 法 ３ 下, ４ 种 组 合 的 蓝 斑 数
１ ０．５ ０．５ １５ ８０
量都较多, 分别为 ６８ 、 ８７ 、 ７８ 和 ８３ , 蓝 斑 的 比 率 为
２ ０．２ ０．２ １５ ８０
３２．５％~５４．０％ .组合 ４ 在方法 ２ 下, 组合 １ 和 ２
３ ０．５ ０．５ ３０ １６０
在方法 ３ 下, 蓝 斑 比 例 超 过 ５０％ , 所 以, 组 合 ４ 用
４ ０．２ ０．２ ３０ １６０
注: 靶点的浓度为 １ μ mol / L . Note : TheconcentrationofthetarＧ 方法 ２ 、 组合 １ 和 ２ 用方法 ３ 都是行之有效的构建
g etsare１ μ mol / L． 方法.
表 ６ 不同浓度组合蓝白斑数目及比例
Table６ Whiteandbluecolon y amountof g rou p swithdifferentconstructionmethods
方法 １ Method１ 方法 ２ Method２ 方法 ３ Method３
组合
蓝斑 白斑 蓝斑比例 / ％ 蓝斑 白斑 蓝斑比例 / ％ 蓝斑 白斑 蓝斑比例 / ％
Grou p s
BCL WCL BCR BCL WCL BCR BCL WCL BCR
１ １０ ８６ １０．４ ４３ ５４ ４４．３ ６８ ６６ ５０．７
２ ９ ２５ ２６．４ ２６ ７０ ２７．１ ８７ ７４ ５４．０
３ １３ ８３ １３．５ ３２ ９３ ２５．６ ７８ １６２ ３２．５
４ ２０ １２２ １４．１ ５１ ３９ ５６．７ ８３ １１７ ４１．５
注 Note : BCL : Bluecolon y ; WCL : Whitecolon y ; BCR : Bluecolon y ratio．