Page 15 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

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华 中 农 业 大 学 学 报 第 ３９ 卷
相应的s g RNA 表达盒切下来, 最后用 GoldenGate 构建双靶点的 CRISPR / Cas９ 载体, 需要２ 个靶
的方法将多个s g RNA 表达盒连接到 CRISPR / Cas９ 点 / RNA 表达盒, 包含 ２ 个启动子和 ２ 个 g RNA ,
g
载体上.第 ２ 种: Gibson 组装法.研究者首先通过 其中１ 个启动子和１ 个 g RNA 已经构建到 p RC３ 或
PCR 制备s g RNA 表达盒, 然后将纯化好的 PCR 产 p RC６b载体上, 因此, 我们将剩下的 １ 个 g RNA 和
物与线性化的载体混合, 加入混合酶反应 [ １６ ] .第 ３ １ 个启动子( P U６a 以及 LacZ 表达盒构建到克隆载
)
种: GoldenGate和 Gatewa y 联用法.该方法分为３ 体 p EASYＧBlunt３ 上.以引物 g RNAＧF 和 g RNAＧ
步: 第 １ 步将设计好的靶点用 T ４ DNA 连接酶构建 R 进行 PCR , 将 g RNA２ 从 p YL g RNAＧOsU６a扩增
到含有不同启动子的 GoldenGate入门载体中; 第２ 出来; 以引物 LacZＧF 和 LacZＧR 进行 PCR , 将 LacZ
步利用 GoldenGate方法将多个 s g RNA 表达盒构 表达盒从 p YL３２２d２ [ ２０ ] 扩增出来; 以引物 U６aＧF 和
建到具有 Gatewa y 重组位点的中间载体上; 第 ３ 步 U６aＧR 进 行 PCR , 将 启 动 子 P U６a 从 p YL g RNAＧ
用 Gatewa y 重组法将 Cas９ 蛋白、 上一步 中的多个 OsU６a扩 增 出 来. 然 后 通 过 重 叠 延 伸 PCR 将
s g RNA 表达盒以及驱动Cas９ 表达的启动子构建到 g RNA２ 、 LacZ 表达盒和 P U６a 连接成为 １ 个 DNA 片
最终的表达载体上 [ １８ ] .第 ４ 种: 同源重组法.首先 段, 最后克隆到 p EASYＧBlunt３ 载体上, 构建为提供
通过两轮 PCR 将同源臂、 tRNA 、 s g RNA１ 和靶点 外源片段 g RNA２ＧLacZＧP U６a 的载体 p GLU６a .
Gl y
扩增到一起, 然后将最终的 PCR 片段利用一步法克 1.3 双靶点 CRISPR/Cas9 载体构建
隆到 BsaⅠ 线性化的表达载体上 [ １９ ] .以上 ４ 种方法 １ ) 靶点设计.利用软件 CRISPRＧP２．０ [ ２１ ] 选择
用于双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建时, 操作复杂、 ２ 个靶点, 第 １ 个靶点的第 １ 个碱基必须是 A 或 G ,
耗时长, 需要经验丰富的科研人员才能顺利完成. 第 ２ 个靶点的第 １ 个碱基必须是 G .靶点第 １ 个碱
本研究基于 GoldenGate 载体构建过程, 建立 基是 A , 则构建到 p RC３ 上, 第 １ 个碱基是 G , 则构
了一 种 简 单 快 速 高 效 且 无 PCR 扩 增 的 双 靶 点 建到 p RC６b上.选择好 ２０nt的靶点后, 给 ２ 个靶
CRISPR / Cas９ 载体构建的方法, 该方法也适用于单 点加好相应的碱基接头.如果靶点 １ 的第 １ 个碱基

靶点 CRISPR / Cas９ 载体的构建. 是 A , 则在正向靶点引物的５′ 端加 GGC , 如果靶点１
的第 １ 个 碱 基 是 G , 则 在 正 向 靶 点 引 物 的 ５′ 端 加
1 材料与方法
GTT , 反向引物的 ５′ 端都是加 AAAC ; 第 ２ 个靶点
1.1 材 料 正向靶点引物的５′ 端加 GCC , ３′ 端加 GTTTT , 反向
载 体 p YLCRISPR / Cas９PubiＧH 、 YL g RNAＧ 靶点引物的 ５′ 端加 CTCTAAAAC .
p
OsU３ 、 YL g RNAＧOsU６a 、 YL g RNAＧOsU６b 和 ２ ) 外源片段 g RNA２ＧLacZＧP U６a 的制备.在靶点
p
p
p YL３２２d２ 来源于华南农业大学生命科学学院刘耀 引物 合 成 之 前,用 限 制 性 内 切 酶 BsaⅠ 酶 切
光教授实验室, DS３５５ 由笔者所在课题组保存.大 p GLU６a , １％~１．５％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳, 利 用 DNA
.
肠杆 菌 感 受 态 细 胞 ( Trans１ＧT１ Pha g e Resistant 纯化回收试剂盒回收外源片段 g RNA２ＧLacZＧP U６a
Chemicall yCom p etentCell和 TransDB３．１ChemiＧ NanoDro p ２０００ 检测浓度后, －２０℃ 保存备用.
call yCom p etentCell ) 和 p EASYＧBlunt３ 购自北京 ３ ) 载 体 的 线 性 化. BsaⅠ 线 性 化 p RC３ 或

全式金生物技术有限公司. p RC６b , 灭 活 备 用.酶 切 体 系 为: 载 体 ３ μ g １０×
,
1.2 双靶点 CRISPR/Cas9 相关载体的构建 CutsmartBuffer５ μ L , ３０UBsaⅠ , ddH ２O 补至 ５０
) )、
将 OsU３启动子( P U３ 或 OsU６b 启动子( P U６b μ L , ３７℃ 酶切 １h .
ccdB 表 达 盒 和 g RNA１ 一 起 克 隆 到 载 体 p YLCＧ ４ ) 靶点接头的制备.靶点引物合成后, 将靶点
RISPR / Cas９PubiＧH 上, 形 成 p RC３ 或 p RC６b 载 体. 引物用 ddH ２O 溶解成 １００ μ mol / L 母液, 各取１ μ L
将启动子 P U３ 和 g RNA１ 从 p YL g RNAＧOsU３ 上扩增 加入 ９８ μ LddH ２O , 混合稀释至 １ μ mol / L . ９０℃ ,
出来; 将 P U６b 从 p YL g RNAＧOsU６b 上 扩 增 出 来; 将 变性 ３０s , 移至室温冷却, 完成退火.
ccdB表达盒从 DS３５５ 上扩增出来( 两端带有 BsaⅠ 酶 ５ ) 连接反应.将 ０．２ 或 ０．５ μ L 靶点引物( 浓度
切位点).将 P U３ ccdB表达盒和 g RNA１克隆到载体 为 １ μ mol / L ), １５ 或 ３０n g 外源片段 g RNA２ＧLacZＧ
、
p YLCRISPR / Cas９PubiＧH 上, 形成骨架载体 p RC３ ; 将 P U６a 和 ８０ 或 １６０n gBsaⅠ 线 性 化 载 体 p RC３ 或
P U６b ccdB 表 达 盒 和 g RNA１ 克 隆 到 载 体 p YLCＧ p RC６b , 利用 NEB T ４ DNA Li g ase 连接, ２０ μ L 反
、
RISPR / Cas９PubiＧH 上, 形成骨架载体 p RC６b . 应体系( ２ μ L１０ × NEB T ４ DNA Li g aseBuffer ,