Page 16 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

第 ３ 期 张扬 等: １ 种简单快速高效的双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建方法 １ １

８０U T ４ DNA Li g ase ), 利用 PCR 仪 １０℃ ５ min , 碱基为 A 的靶点, RC６b适用于第１ 个碱基为 G 的
p
２０℃ ５min , 反应 １０~１５ 个循环. 靶点. ccdB 编码１ 个毒素蛋白, 可以使 Trans１ＧT１
６ ) 连接产物转化大肠杆菌 Trans１ＧT１ . 大肠杆菌致死( 图 １D , E ), 通过ccdB 毒素蛋白的作
1.4 引 物 用, 线性化不完全的质粒载体不能生长, 从而大幅度
本研究所用引物见表 １~ 表 ４ . 提高重 组 质 粒 的 阳 性 率. ccdB 的 两 端 各 有 １ 个
2 结果与分析 BsaⅠ 酶 切 位 点 ( 图 １ A ), 用 于 线 性 化 p RC３ 或
p RC６b ( 图 １B ), 由 于 BsaⅠ 是 第 ２ 类 限 制 性 内 切
2.1 双靶点 CRISPR/Cas9 相关载体的构建 酶, 识别位点和切割位点不一致( 图 １C ), 所 以 可
为方 便 选 择 不 同 的 靶 点 序 列, 我 们 构 建 了 以产生 不 同 的 黏 性 末 端 供 多 个 外 源 DNA 片 段
p RC３ 和 p RC６b载体( 图 １A ), RC３ 适用于第 １ 个 连接.
p
表 １ 双靶点 CRISPR / Cas９ 相关载体构建的引物
Table１ PrimersforconstructionofdualＧtar g etCRISPR / Cas９Ｇrelatedvectors
引物名称 正向引物( ５′Ｇ３′ ) 反向引物( ５′Ｇ３′ )
Primers Forwardp rimer ( ５′Ｇ３′ ) Reversep rimer ( ５′Ｇ３′ )
g RNA GGTCTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA TGTCAGGGTCCATCCAC
GTGGATGGACCCTGACAGGCTTTACACTTＧ ATCCTTTGCTGCCGATTCCAGATCTTAGCTＧ
LacZ
TATGCTTC GCGCGTAACC
U６a CTGGAATCGGCAGCAAAGGAT GGTCTCTCGGCAGCCAAGCCAGC
表 ２ OsPGL１ 双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建的引物
Table２ PrimersforconstructionofdualＧtar g etCRISPR / Cas９vectorsa g ainstOsPGL１
引物名称 正向引物( ５′Ｇ３′ ) 反向引物( ５′Ｇ３′ )
Primers Forwardp rimer ( ５′Ｇ３′ ) Reversep rimer ( ５′Ｇ３′ )
PGL１U３ GGCATGCCCGCGCTGAGGTCGCG AAACCGCGACCTCAGCGCGGGCA
PGL１U６a GCCGCACCAACCGGTCTCCATGAGTTTT CTCTAAAACTCATGGAGACCGGTTGGTG
PGL１U６b GTTGCATTGCGTCGAACACAGCG AAACCGCTGTGTTCGACGCAATG
注: GGC 表示用于 U３ 启动子的正向引物靶点接头; GCC 表示用于 U６a启动子的正向引物靶点接头; GTTTT 表示用于 U６a启动子的正
向引物靶点 的 ３′ 端 接 头; GTT 表 示 用 于 U６b 启 动 子 的 正 向 引 物 靶 点 接 头; AAAC 表 示 用 于 U３ / U６b 启 动 子 的 反 向 引 物 靶 点 接 头;
CTCTAAAAC 表示用于 U６a启动子 的 反 向 引 物 靶 点 接 头. Note : GGCre p resentsaforwardp rimertar g etlinkerfortheU３p romoter ;
GCCre p resentsaforwardp rimertar g et５′linkerfortheU６ap romoter ; GTTTTre p resentsaforwardp rimertar g et３′linkerfortheU６a
p romoter ; GTTre p resentsaforwardp rimertar g etlinkerfortheU６bp romoter ; AAACre p resentsareversep rimertar g etlinkerforthe
U３ / U６bp romoter ; CTCTAAAACre p resentsareversep rimertar g etlinkerfortheU６ap romoter． 下同 Thesameasfollows．
表 ３ １０ 个水稻基因双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建的引物
Table３ PrimersforconstructionofdualＧtar g etCRISPR / Cas９vectorsa g ainst１０rice g enes
引物名称 正向引物( ５′Ｇ３′ ) 反向引物( ５′Ｇ３′ )
Primers Forwardp rimer ( ５′Ｇ３′ ) Reversep rimer ( ５′Ｇ３′ )
YS８３U３ GGCAATCCCCTGGTACACAGCGG AAACCCGCTGTGTACCAGGGGAT
YS８３U６a GCCGATGAGAGAAGAGTGCAGAGGTTTT CTCTAAAACCTCTGCACTCTTCTCTCAT
YS８３U６b GTTGGGATTGGGAGAAATCGTGG AAACCCACGATTTCTCCCAATCC
YGL２U３ GGCAAGGTGCTCGACGATGGCGA AAACTCGCCATCGTCGAGCACCT
YGL２U６a GCCGTTCGTGGAGGAGATGAGGGGTTTT CTCTAAAACCCCTCATCTCCTCCACGAA
YGL２U６b GTTGCAGCAATGGCGTCTCGAGG AAACCCTCGAGACGCCATTGCTG
TCD５U３ GGCACACAAGGAGCTGCTCCGGA AAACTCCGGAGCAGCTCCTTGTG
TCD５U６a GCCGGAAGGAAGAACGGAGAGCGGTTTT CTCTAAAACCGCTCTCCGTTCTTCCTTC
TCD５U６b GTTGATGGCTTGGAGGAGCGGCG AAACCGCCGCTCCTCCAAGCCAT
FLN１U３ GGCATCGCGCTCACCAGGCTCGG AAACCCGAGCCTGGTGAGCGCGA
FLN１U６a GCCGAAGGAGGATGAGGTCCGGGGTTTT CTCTAAAACCCCGGACCTCATCCTCCTT
FLN１U６b GTTGCACTCGCTCGCAGTTCATG AAACCATGAACTGCGAGCGAGTG