Page 17 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

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华 中 农 业 大 学 学 报 第 ３９ 卷
续表 ３ContinuedTable３
引物名称 正向引物( ５′Ｇ３′ ) 反向引物( ５′Ｇ３′ )
Primers Forwardp rimer ( ５′Ｇ３′ ) Reversep rimer ( ５′Ｇ３′ )
YSAU３ GGCAGAAAGGAGCGACCACCCGA AAACTCGGGTGGTCGCTCCTTTC
YSAU６a GCCGATCATCCGCAAGCTCGGCGGTTTT CTCTAAAACCGCCGAGCTTGCGGATGAT
YSAU６b GTTGCTGCTCCTGGCCAGCCGCC AAACGGCGGCTGGCCAGGAGCAG
YSAU３ GGCAGAAAGGAGCGACCACCCGA AAACTCGGGTGGTCGCTCCTTTC
YSAU６a GCCGATCATCCGCAAGCTCGGCGGTTTT CTCTAAAACCGCCGAGCTTGCGGATGAT
YSAU６b GTTGCTGCTCCTGGCCAGCCGCC AAACGGCGGCTGGCCAGGAGCAG
CYO１U３ GGCACGAGTGGACGGGCAAGTGC AAACGCACTTGCCCGTCCACTCG
CYO１U６a GCCGGAGGAGGAGAAGAAGGGGAGTTTT CTCTAAAACTCCCCTTCTTCTCCTCCTC
CYO１U６b GTTGCAAGTGCCGGAGTTGCCAG AAACCTGGCAACTCCGGCACTTG
NTRCU３ GGCAGTGATGGAAGAAGGCCCTG AAACCAGGGCCTTCTTCCATCAC
NTRCU６a GCCGCAGCTGATGACCACCACCGGTTTT CTCTAAAACCGGTGGTGGTCATCAGCTG
NTRCU６b GTTGATGGAAGAAGGCCCTGCGG AAACCCGCAGGGCCTTCTTCCAT
Cl p P５U３ GGCAATCCCGCTCCTCTGATGAG AAACCTCATCAGAGGAGCGGGAT
Cl p P５U６a GCCGGTGGTGGTCGCCATGGCCGGTTTT CTCTAAAACCGGCCATGGCGACCACCAC
Cl p P５U６b GTTGCCCCGACGCATACTCCACA AAACTGTGGAGTATGCGTCGGGG
TLP２７U３ GGCATTCTTCTCCGCAGAGGCGG AAACCCGCCTCTGCGGAGAAGAA
TLP２７U６a GCCGCCGCCTCTGCGGAGAAGAAGTTTT CTCTAAAACTTCTTCTCCGCAGAGGCGG
TLP２７U６b GTTGCCGCCTCTGCGGAGAAGAA AAACTTCTTCTCCGCAGAGGCGG
TLP２７U６a２ GCCGTATTAGCGGGGACGATGAGGTTTT CTCTAAAACCTCATCGTCCCCGCTAATA
SKIPaU３ GGCACGACCACAGCAGCGACCCG AAACCGGGTCGCTGCTGTGGTCG
SKIPaU６a GCCGGTTGCCTCGGAATCAGCCGGTTTT CTCTAAAACCGGCTGATTCCGAGGCAAC
SKIPaU６b GTTGGTTGCCTCGGAATCAGCCG AAACCGGCTGATTCCGAGGCAAC

表 ４ OsCYO１ 和 OsSKIPa 单靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建的引物
Table４ Primersforconstructionofsin g leＧtar g etCRISPR / Cas９vectorsa g ainstOsCYO１andOsSKIPa
引物名称 正向引物( ５′Ｇ３′ ) 反向引物( ５′Ｇ３′ )
Primers Forwardp rimer ( ５′Ｇ３′ ) Reversep rimer ( ５′Ｇ３′ )
oCYO１U６b GTTGCAAGTGCCGGAGTTGCCAGGTTTT CTCTAAAACCTGGCAACTCCGGCACTTG
oSKIPaU６b GTTGGTTGCCTCGGAATCAGCCGGTTTT CTCTAAAACCGGCTGATTCCGAGGCAAC

p GLU６a ( 图 １ F ) 上 含 有 外 源 片 段 g RNA２Ｇ p RC３ 上, 第 １ 个碱基是 G , 则构建到 p RC６b上.选
. 用 BsaⅠ 可 将 g RNA２ＧLacZＧP U６a 从 择好 ２０nt的靶点后, 按图 ２A 的方法加好相应的
LacZＧP U６a
p GLU６a上切下来( 图 １G ), 回收后即可用于连接. 碱基接头.要注意的是给第 ２ 个靶点 加接头碱基
LacZ 报告基因在含有 IPTG 和 XＧ g al的平板培养 时, 正向靶点引物的 ３′ 端需要加上 GTTTT 这 ５ 个
基上, 可使 Trans１ＧT１ 大肠杆菌显蓝( 图 １ H ), 从 碱基, 反向靶点引物的 ５′ 端要加上 CTCTAAAAC
而提高阳性克隆的概率. 这 ９ 个碱基.
2.2 双靶点 CRISPR/Cas9 载体构建流程 在靶点引物合成之前, 用限制性内切酶 BsaⅠ
[ ２１ ] 选择 酶 切 p GLU６a , 回 收 外 源 片 段 g RNA２ＧLacZＧP U６a 备
首先设计靶点: 用软件 CRISPRＧP２．０
２ 个靶点, 由于本系统中用 Ⅲ 型启动子( P U３ P U６b 和 用. BsaⅠ 线 性 化 p RC３ 或 p RC６b , 灭 活 备 用. 靶
、
P U６a 来表达 s g RNA , 所以选择靶点时第 １ 个靶点 点引物合 成 完 成 以 后, 只 需 将 对 应 的 正 向 和 反 向
)
的第 １ 个碱基必须是 A 或 G , 第 ２ 个靶点的第 １ 个 引物 变 性 退 火, 形 成 带 有 黏 性 末 端 的 DNA 小
碱基必 须 是 G .靶 点 第 １ 个 碱 基 是 A , 则 构 建 到 片段.