Page 14 - 《华农农业大学学报》2020年第3期
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第 ３９ 卷 第 ３ 期                      华   中   农   业   大   学   学   报                     Vol．３９ No．３
               ２０２０ 年  ５ 月                   JournalofHuazhon gA g riculturalUniversit y         Ma y２０２０ , ９~１８


               张扬, 黄维峰, 周菲, 等 ．１ 种简单快速高效的双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建方法[ J ] ． 华中农业大学学报, ２０２０ , ３９ ( ３ ): ９Ｇ１８．
               DOI : １０．１３３００ / j ．cnki．hnlkxb．２０２０．０３．００２

                  1 种简单快速高效的双靶点 CRISPR/Cas9 载体构建方法


                                              张扬, 黄维峰, 周菲, 林拥军



                                华中农业大学生命科学技术学院 / 作物遗传改良国家重点实验室, 武汉 ４３００７０

                       摘要   基于 GoldenGate载体构建过程, 对 CRISPR / Cas９ 双靶点敲除技术的载体构建系统进行了优化, 建
                   立了一种简单快速高效且无 PCR 扩增的双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建方法.在本方法中, 只需将 设 计 好 的
                   ２ 个靶点 DNA 小片段和 １ 个外源片段用 T ４ DNA 连接酶构建到 CRISPR / Cas９ 载体上即可.用本方法对 １０ 个
                   已报道的水稻基因构建了２０ 个双靶点 CRISPR / Cas９ 载体, 阳性率为１００％ , 测序结果显示无突变.该载体系统
                   非常适合大批量 CRISPR / Cas９ 载体的构建, 同时也为其他植物中构建双靶点 CRISPR / Cas９ 载体提供借鉴.
                       关键词   水稻; CRISPR / Cas９ ;基因敲除;基因编辑;双靶点;载体构建
                       中图分类号  Q７８   文献标识码  A   文章编号  １０００Ｇ２４２１ ( ２０２０ ) ０３Ｇ０００９Ｇ１０

                 CRISPR ( clusteredre g ularl y inters p acedshort p alＧ 因此, PCR 产物测序法是一种费时费力的基因型鉴
               indromicre p eats )/ Cas ( CRISPRＧassociatedg ene ) 系 统  定方法.为了简单快速鉴定 CRISPR / Cas９ 编辑体
               最早是在Stre p tococcus py o g enes 细菌中发现的, 它是      的基因型, 很多学者用 ２ 个靶点去编辑 １ 个基因, 当
               一种原核 免 疫 系 统, 通 过 选 择 性 靶 向 和 破 坏 外 源 １ 个 DNA 序列上有 ２ 个位置发生双链断裂后, 中间
               DNA 如病毒来保护细胞          [ １ ] . CRISPR / Cas９ 是一种  的片段可能发生丢失          [ ９Ｇ１２ ] , 从而只需要在靶点上下
               基于 Ⅱ 型 CRISPR 的高效基因编辑系统, 主要有 ３ 游设计引物, 进行 PCR 扩增后, 将 PCR 产物进行琼
                                                          [ １ ]
               个组 分: Cas９ 蛋 白、 tracrRNA 和 p reＧcrRNA        . 脂糖凝胶电泳即可鉴定编辑体的基因型. EncisoＧ
               CRISPR / Cas９ 系统 在 植 物 基 因 编 辑 中 应 用 广 泛. Rodri g uez等      [ １３ ] 利用 CRISPR / Cas９ 双靶点敲除马
               自 ２０１３ 年成功用于拟南芥、 烟草和水稻的基因编                      铃薯 SＧRNase , 在 T ０ 代成功获得了 １０ 株中间片段
               辑  [ ２Ｇ４ ] 以来, CRISPR / Cas９ 已在水稻、 小麦、 烟草、 拟    丢失的突 变 体, 缺 失 片 段 达 到 ５８０b p 在 拟 南 芥
                                                                                                  .
               南芥、 高粱、 番茄、 玉米、 马铃薯、 杨树、 豆类、 大麦、 苔              中, 利用这种双靶点 CRISPR / Cas９ 敲除策略, 成功
               藓、 甘蓝、 甜橙、 苹果、 苔藓、 葡萄、 莴苣、 棉花、 莲藕、 删除了 １．７~１３kbDNA 片段                      [ １２ ] .在水稻中可以删
               蒲公英、 亚麻、 矮牵牛、 柑橘、 西瓜、 蘑菇、 油菜和梨树                 除０．２~２４５kb的 DNA 片段, 而删除４３０b p 的 DNA
               中实现编辑功能        [ ５Ｇ７ ] . CRISPR / Cas９ 被认为是第 ３ 片段的概率高达２２．２％           [ １４Ｇ１５ ] .所以说双靶点敲除单
               代基因编辑工具, Cas９ 在s g RNA 的引导下, 可以对                个基因是一种易于检测且高效的基因编辑方法.
               靶标序列的双链进行切割, 使 DNA 双链断裂, 从而                          目前在植物中, 主要采用以下 ４ 种方法来构建
               激活细胞的 DNA 双链断裂修复功能                [ ８ ] .在修复过   双靶点 CRISPR / Cas９ 载体.第 １ 种: GoldenGate
               程中, 会发生少量碱基的替换、 缺失或插入, 从而导                      组装法. Ma等      [ １６ ] 通过边切边连( BsaⅠ 酶切, T ４ 连
               致基因被编辑.基因被编辑以后, 可以采用 PCR 产                      接酶连接)、 重叠延伸 PCR 制备 ２ 个两端带有 BsaⅠ
               物测序法鉴定基因型.由于测序之前并不知道基因                          酶切位点的 s g RNA 表达盒, 然后利用“ 边切边连”
               型, 所以要对多个家系测序, 以获得理想 的编辑材                       法组 装 s g RNA 表 达 盒 到 p YLCRISPR / Cas９ 载 体
               料; 同时, 测序质量的好坏也会影响对基因 型的判                       上. Zhan g 等  [ １７ ] 是先将多个设计好的靶点 DNA 小
               断, 所以需要重复测序才能确定最终基因型; 此外, 片段 用 T ４ DNA 连 接 酶 构 建 到 BbsⅠ 线 性 化 的
               由于 DNA 序列存在复杂结构, 可能导致测序失败. s g RNA 入门载体上, 然后用不同的限制性内切酶将


               收稿日期: ２０１９Ｇ０５Ｇ１４
               基金项目:国家重大科技专项( ２０１６ZX０８００１Ｇ００１ )
               张扬, 硕士研究生 ． 研究方向: 水稻基因工程 ．EＧmail : zhan gy an g ９２０５０７＠１６３．com
               通信作者:林拥军, 博士, 教授 ． 研究方向:水稻基因组学 ．EＧmail : y on gj unlin＠mail．hzau．edu．cn
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