Page 20 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

第 ３ 期 张扬 等: １ 种简单快速高效的双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建方法 １ ５

为了进一步确认蓝斑是否为阳性, 每个皿上挑 结果显示: 所有蓝斑都是重组质粒( 图 ３ ), 并且经测
３ 个蓝斑, 于液体 LB 培养基 ３７℃ 、 １８０r / min 培养 序验证所有重组质粒都未发生碱基突变.以上结果
过夜, 用碱裂解法抽提质粒, 然后以空载体 p RC３ 为 表明本方法是一种高效率的双靶点 CRISPR / Cas９
对照, 用限制性内切酶 MluⅠ 和 BamHⅠ 酶切验证. 载体构建方法.

A : 方法１ 质粒酶切胶图; B : 方法２ 质粒酶切胶图; C : 方法３ 质粒酶切胶图. M 表示 DNA 分子标记. A g arose g elanal y sisofdualＧtar g et
CRISPR / Cas９constructionswithMethod１ ( A ), Method２ ( B ), Method３ ( C ), whichweredi g estedwithMluⅠ andBamHⅠ．M : Marker．
图 ３ 不同连接方法质粒酶切胶图
Fi g ．３ A g aroseg elanal y sisofdualＧtar g etCRISPR / Cas９constructionswithdifferentmethods

2.4 本研究构建的载体系统的适用性检测 2.5 单靶点载体的适用性检测
为了探究本研究构建的载体系统是否适用于水 为验证本研究构建的载体系统是否可以用于单
稻中 其 他 的 基 因, 选 用 １０ 个 已 报 道 的 水 稻 基 因 靶点 CRISPR / Cas９ 载 体 构 建, 我 们 选 用 OsCYO１
[ ２１ ]
YS８３ 、 YGL２ 、 TCD５ 、 OsFLN１ 、 YSA 、 OsCYO１ 、 和 OsSKIPa , 利用软件 CRISPRＧP２．０ 选择第 １
NTRC 、 OsCl p P５ 、 OsTLP２７ 和 OsSKIPa [ ２３Ｇ３２ ] , 每 个碱 基 为 G 的 靶 点.在 正 向 靶 点 引 物 的 ５′ 端 加
个基因分别设计 ３ 对靶点引物( 表 ３ ), 构建到 p RC３ GTT , ３′ 端 加 GTTTT , 反 向 靶 点 引 物 的 ５′ 端 加
和 p RC６b上, 共计 ２０ 个载体.连接产物转化大肠 CTCTAAAAC ( 表 ４ ). ２ 个靶点引物混合在一起,
杆菌 Trans１ＧT１ 感 受 态 细 胞, ３７ ℃ 培 养 过 夜, LB 变性退火后, 将 ０．２ μ L 靶点引物( 浓度为 １ μ mol / L )
培养 皿 上 蓝 白 斑 明 显, 每 个 皿 上 挑 ３ 个 蓝 斑, 用 和 ８０n gBsaⅠ 线性化载体 p RC６b 混合在一起, 总
MluⅠ 和BamHⅠ 酶切验证后送公司测序, 酶切和测 共２０ μ L 反应体系( ２ μ L１０×NEBT４DNALi g ase
序结 果 均 显 示 为 正 确 的 克 隆, 阳 性 率 为 １００％ Buffer , ８０ U T ４ DNA Li g ase ), 利用 PCR 仪 １０ ℃
( 图 ４ ), 且测序显示无突变.这说明该方法适用于 ５min , ２０℃ ５min , 反应 １０~１５ 个循环.连接产物
水稻基因 的 双 靶 点 CRISPR / Cas９ 载 体 构 建, 而 且 转化大肠杆菌 Trans１ＧT１ .

非常高效. 随机挑取 ８ 个单菌落, 经碱裂解法抽提质粒, 用