Page 22 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

第 ３ 期 张扬 等: １ 种简单快速高效的双靶点 CRISPR / Cas９ 载体构建方法 １ ７

１００％ .此外, 本方法构建 CRISPR / Cas９ 载体不需 [ ８ ] CONG L , RAN F A , COX D , etal．Multi p lexg enomeen g iＧ
要经过 PCR 反应过程, 大大降低了外源片段的突变 neerin gusin g CRISPR / Cass y stems [ J ] ．Science , ２０１３ , ３３９
( ６１２１ ): ８１９Ｇ８２３．
概率, 可以确保重组质粒测序正确率为 １００％ .本
[ ９ ] BROOKSC , NEKRASOV V , LIPPMAN ZB , etal．Efficient
研究选取了 １０ 个已报道的水稻基因, 利用本载体系
g eneeditin g intomatointhefirstg enerationusin gtheclusＧ
统构建了 ２０ 个双靶点 CRISPR / Cas９ 载体( 图 ４ ), teredre g ularl y inters p acedshort p alindromicre p eats / CRISPRＧ
挑取蓝色克隆酶切验证并测序发现, 阳性克隆概率 associated９s y stem [ J ] ．Plantp h y siolo gy , ２０１４ , １６６ ( ３ ): １２９２Ｇ
为 １００％ . １２９７．
[ １０ ] SONG Y , YUANL , WANG Y , etal．Efficientduals g RNAＧdiＧ
本 研 究 中 CRISPR / Cas９ 相 关 载 体 p RC３ 、
rectedlar g eg enedeletioninrabbitwithCRISPR / Cas９s y stem
p RC６b和 p GLU６a 上的 Cas９ 、 启动子和 g RNA 相
[ J ] ．Cellularand molecularlifesciences , ２０１６ , ７３ ( １５ ): ２９５９Ｇ
关元件均是从华南农业大学刘耀光教授课题组的植
２９６８．
物基因组编辑双元载体和 s g RNA 中间载体上扩增 [ １１ ] SRIVASTAVA V , UNDERWOODJL , ZHAOS．DualＧtar g eＧ
获得的, 未改变其碱基序列, 所以, 理论上本载体系 tin gb yCRISPR / Cas９forp reciseexcisionoftrans g enesfrom
统的植物基因组编辑效率与刘耀光教授课题组的双 rice g enome [ J ] ．Plantcell , tissueandor g anculture , ２０１７ , １２９
( １ ): １５３Ｇ１６０．
元载体系统没有差异, 具体的编辑效率需要通过进
[ １２ ] WU R , LUCKE M , JANGYT , etal．AnefficientCRISPRvecＧ
一步的水稻遗传转化实验检测.
tortoolbox foren g ineerin glar g e deletionsin Arabido p sis
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