Page 40 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第2期

34 华 中 农 业 大 学 学 报 第 42 卷

别于免疫后 7 d及 21 d剖杀，另 5只空白小鼠，均取肺 根据扩增曲线和 Ct值进行判断最终优化条件。不同
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组织作为实用性检测的阴性样本。分别剪取阴性和 温度下的荧光扩增结果、不同 Mg 浓度下的荧光扩
阳性小块肺组织，用 TIANamp Genomic DNA Kit 增结果、不同浓度下的荧光扩增结果、不同环引物浓
（DP304）试剂盒提取 DNA，然后进行普通 PCR 和可 度下的荧光扩增结果分别如图 1A~D 所示，分别在
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视化LAMP检测对比实用性效果。 扩增温度为 68.2 ℃时、在 Mg 浓度为 6 mmol/L 时、
2 结果与分析 在 dNTPs 为 1.6 mmol/L 时 、在 环 引 物 浓 度 为 0.4
μmol/L 时 ，Ct 值 最 小 ，扩 增 效 率 最 高 ，故 选 择
2.1 可视化LAMP检测方法的建立 68.2 ℃、6 mmol/L Mg 浓度、1.6 mmol/L dNTPs 浓
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1）反应条件的优化。在 25 μL 体系中，对温度、 度、0.4 μmol/L 环引物浓度为可视化 LAMP 方法的
Mg 浓度、dNTPs 浓度、环引物浓度分别进行优化， 优化条件。
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图1 可视化LAMP方法的温度（A），Mg 浓度（B），dNTPs浓度（C）和环引物浓度（D）优化
Fig.1 Temperature （A） ， Mg concentration（B）， dNTPs concentration（C） and loop primers
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concentration（D） optimization of visual LAMP
即优化后最适反应体系（25 μL）及条件为：2.5 3） 灵敏度检测。将制备的溶血性曼氏杆菌 A6-
μL 10× Isothermal Amlification Buffer、6 mmol/L ZMD 菌液和 lktC 重组质粒分别以 10 倍倍比稀释检
MgSO 4 （1.5 μL、100 mmol/L的 MgSO 4 ）、1.6 mmol/L 测可视化 LAMP 的灵敏度，同时检测 PCR 方法的灵
dNTPs（4.0 μL、10 mmol/L 的 dNTPs）、0.4 μmol/L 敏度用作对照。结果显示，所建立的可视化 LAMP
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LB（1.0 μL、10 μmol/L 的 LB）、4.0 μL 10 μmol/L 方法检测菌液的检测限为 6.7×10 CFU/μL（图
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的 FIP、4.0 μL 10 μmol/L 的 BIP、0.5 μL 10 μmol/L 3），检测质粒的检测限为7.9×10 copies/μL（图4）。
的 F3、0.5 μL 10 μmol/L 的 B3、1 μL Bst 2.0（8 000 普 通 PCR 方 法 检 测 菌 液 的 检 测 限 为 6.7×
0
U/mL）、1 μL 重组质粒或细菌模板、5 μL ddH 2 O。 10 CFU/μL（图 5），检测质粒的检测限为 7.9×10
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2） 特异性检测。用所建立的可视化 LAMP 方 copies/μL（图 6）。 结 果 显 示 ，所 建 立 的 可 视 化
法对“材料与方法 1.1”所述的 15 种病原进行检测，结 LAMP 方法用以检测溶血性曼氏杆菌的菌液和质
果显示，仅溶血性曼氏杆菌 A1、A2 和 A6 所对应的 粒，其灵敏度均高于普通PCR方法。
2~4 号反应管中出现可视化颜色变化，呈荧光绿色， 2.2 可视化LAMP的实用性检测
判为阳性，其他病原所对应的反应管均为橙黄色，判 同时采用可视化 LAMP 和 PCR 方法对已知背
定为阴性；在琼脂糖凝胶图像中，仅 2~4 泳道有典型 景的小鼠肺组织进行检测。结果显示，2 种方法均能
的梯状条带。结果表明，所建立的可视化 LAMP 方 够准确检测出 15 份阴性（图 7），表明 2 种方法的特异
法具有较高的特异性，且能够检测溶血性曼氏杆菌 性良好，均为 100%（95% CI：78.2%，100.0%）。且
A1、A2 和 A6 型 ，与 其 他 病 原 不 发 生 交 叉 反 可视化 LAMP 能够准确检测出所有的 15 份阳性，敏
应（图2）。 感性达到 100%（95% CI：78.2%，100.0%），而普通