Page 38 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第2期

第42卷 第2期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol.42 No.2
2023年 3月 Journal of Huazhong Agricultural University Mar. 2023，32~37

分离并保存。 应体系为 10× Isothermal Amlification Buffer 2.5 μL、
刘宁宁，易萍，郭爱珍，等.牛溶血性曼氏杆菌可视化LAMP检测方法的建立［J］.华中农业大学学报，2023，42（2）：32⁃37.
DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2023.02.005 lktC 重组质粒及溶血曼氏杆菌灭活疫苗由华中 MgSO 4 （100 mmol/L） 1.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）
农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实 3.5 μL、LB（10 μmol/L）1.0 μL、FIP（10 μmol/L）4.0
牛溶血性曼氏杆菌可视化LAMP检测方法的建立 验室反刍动物疾病研究室构建、制备并保存。 μL、BIP（10 μmol/L）4.0 μL、F3（10 μmol/L）0.5 μL、

1.2 培养基和主要试剂 B3（10 μmol/L）0.5 μL、Bst 2.0 DNA 聚合酶（8 000
刘宁宁 ，易萍 ，郭爱珍 1，2，3 ，胡长敏 ，陈颖钰 1，2 本研究所使用的 LB/Amp 培养基、LB/Amp 平 U/mL）1 μL、DNA模板1 μL以及ddH 2 O 5.5 μL。采
1
1
1
板培养基和 TSB 培养基均按说明书常规配制。主要 用控制变量法对反应条件和反应体系进行优化，温
1.华中农业大学动物医学院/农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室，武汉 430070；
试剂 Bst 2.0 DNA Polymerase、MgSO 4 、dNTPs 购自 度 分 别 以 60.6、62.5、65.0、67.0、和 68.2 ℃ 进 行 反
2.湖北省兽医流行病学国际科技合作基地，武汉 430070； 3.湖北洪山实验室， 武汉 430070
Bio-Rad Laboratories；Eva Green20×染料购自 Bio⁃ 应；Mg 2+ 浓度分别以 0、2、4、6、8 和 10 mmol/L 进
摘要 为建立一种能够快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）的可视化 LAMP 检测 tium；SYBR Green I 染料、 6×Loading buffer 购自南 行反应；dNTPs 浓度分别以 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和
法，利用 LAMP 引物设计软件，以溶血性曼氏杆菌保守基因 lktC 序列设计内引物、外引物及环引物，对其反应温 京诺唯赞生物有限公司。 1.6 mmol/L 进 行 反 应 ；环 引 物 分 别 以 0、0.2、0.4、
度、Mg 浓度、dNTPs 浓度等条件进行优化，并检测了方法的敏感性、特异性及实用性。结果显示，该方法在 1.3 引物的设计与合成 0.6、0.8 和 1.0 μmol/L 进行反应，反应结束后 Ct 值
2+
68.2 ℃、6 mmol/L Mg 、1.6 mmol/L dNTPs 条件下达到最佳，40 min 内完成检测并可通过肉眼判定结果，对细 依据溶血性曼氏杆菌 lktC 基因序列（GenBank 越小说明反应速度越快。荧光定量 PCR 中 Ct 值最
2+
2
-1
菌的最低检测限为 6.7×10 cfu/μL，对 lktC 重组质粒的最低检测限为 7.9×10 copies/μL，敏感性高；与 15种病 登录号：CP017484.1）进行引物设计。包含 2 条内引 小的组对应的反应体系即为可视化 LAMP 的反应
原均不发生交叉反应，特异性好；对背景清晰小鼠肺组织样本检测结果显示该方法实用性良好，且优于普通
物（FIP/BIP），2 条 外 引 物（F3/B3）和 1 条 环 引 物 条件。
PCR方法。表明该方法可快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌。
（LB），引物信息如表 1 所示，引物由武汉擎科生物有 依据荧光定量 PCR 所确立的各项体系完成反应
关键词 环介导等温扩增 （LAMP）； lktC基因； 溶血性曼氏杆菌； 可视化检测； 综合防控
限公司合成。
中图分类号 S852.61 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2023）02-0032-06 液的配制。随后在反应液上方滴加 30 µL 液体石蜡
表1 本研究中所用引物信息 进行封闭，并在反应管管盖上滴加 0.2 µL SYBR
Table 1 Primers used in this study
溶血性曼氏杆菌 （Mannheimia haemolytica） 是 因，具有灵敏、便捷等优点，能够满足普通农场检测 Green Ⅰ 染料。将反应管置于 68.2 ℃恒温水浴锅中
［9］
引起牛呼吸道疾病综合征的机会性病原，在运输等 的需要 。 水浴 40 min，反应结束后轻甩反应管，使染料与反应
应激环境或其他病原混合感染情况下，可侵袭动物 LktC（leukotoxin C）基因是由溶血性曼氏杆菌产 液充分混合，在自然光下观察颜色变化。如反应管
肺部引起呼吸道疾病，主要表现为呼吸困难、食欲下 生的一种具有酰化作用的钙依赖性细胞毒素，属于 中溶液由无色变为荧光绿色则判为阳性，由无色变
降、精神沉郁、发热和流鼻涕等，严重的感染 48 h 后 重复子毒素（repeat in toxin ， RTX）家族，高度保守， 为橙黄色则判为阴性。
［1］
死亡 。由该菌感染导致的疾病已在全球广泛分布， 能够作为溶血性曼氏杆菌较好的诊断靶点。因此， 2）特异性检测。采用本文“材料与方法1.1”所述
引起的死亡损失仅在北美就已超 10 亿美元 。快速 本研究以 lktC 基因为基础，建立了一套能够用于牛 的 15 种病原进行特异性检测。提取该 15 种病原的
［2］
准确地对感染动物进行诊断，是采取积极和有效措 溶血性曼氏杆菌检测的可视化 LAMP 方法，以期为 DNA 作为模板，用最终优化后的反应体系分别对这
施防控溶血性曼氏杆菌病的关键。 我 国 牛 溶 血 性 曼 氏 杆 菌 病 的 防 控 提 供 新 的 技 术 15 种病原进行检测，根据反应管中颜色的变化判断
1.4 阳性对照的制备
目前，用于溶血性曼氏杆菌病诊断的方法主要 支持。 可视化 LAMP 的特异性。牛溶血性曼氏杆菌（A1、
1）含有 lktC基因的重组质粒的制备。在 pUC 57
［6］
［3］
包括普通 PCR 、多重 PCR ［4-5］ 、荧光定量 PCR 和 1 材料与方法 载 体 上 插 入 lktC 基 因（GenBank 登 录 号 ： A2、A6 型）菌株检测为阳性，其他病原检测为阴性即
［7］
PCR-ELISA 等。但应用这些方法进行检测时需 CP017484.1）238 bp 片段，构成 lktC 基因重组质粒。 为特异性良好。
要昂贵的仪器设备，耗费时间长，不利于临床推广使 1.1 供试病原和质粒 9 -1
将含有 lktC 质粒的菌液在 LB/Amp 液体培养基中 3）灵敏度检测。分别以7.9×10 ~7.9×10 cop⁃
用。LAMP 方法因灵敏度高、特异性强、成本低等优 本研究中所用到的牛溶血性曼氏杆菌（A1、A2、 5 -4
37 ℃、180 r/min 培养 12 h，用 Omega D6943-02 质粒 ies/μL 质粒 DNA 以及 6.7×10 ~6.7×10 cfu/μL
［8］
点而广泛应用于临床检测 ，但常规 LAMP 方法易 A6型）菌株、牛多杀性巴氏杆菌（A型、B型、F型）、牛
小提试剂盒提取 DNA 作为阳性对照（提取步骤参照 的细菌 DNA 为模板，双蒸水为阴性对照，进行基于
污染，荧光 LAMP 方法又费用高昂，很大程度上限制 支原体、牛鼠伤寒沙门氏菌、牛产肠毒素型大肠杆
试剂盒说明书），-20 ℃保存备用。 lktC重组质粒检测的可视化 LAMP和普通 PCR的灵
了这些方法的推广使用。 菌、牛副流感 3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒
2）溶血性曼氏杆菌 DNA 的制备。将溶血性曼 敏度分析，根据反应管中颜色的变化判断可视化
环介导等温扩增 （loop-mediated isothermal am⁃ 性腹泻病毒 1 型、牛轮状病毒、牛冠状病毒和牛传染
氏杆菌接种于 TSB 培养基中，37 ℃、180 r/min 培 LAMP 能检测质粒和细菌 DNA 的灵敏度。检测出
plification， LAMP） 是一种类似于 PCR 的核酸扩增 性鼻气管炎病毒等均由华中农业大学农业微生物资
养 6 h；依照参考文献［3］所述方法，挑取单菌落置 来的质粒拷贝数越低，或细菌菌量越低，则表明灵敏
方法，可以在恒温条件下（65 ℃左右）快速扩增靶基 源发掘与利用全国重点实验室反刍动物疾病研究室
于 20 μL 无菌水中 ，煮沸 10 min 后冰浴 1 min，于 度越高。
10 000 r/min 离心 2 min 后吸取上清作为阳性对照， 1.6 可视化LAMP的实用性检测
收稿日期： 2022 ⁃ 10 ⁃ 11
基金项目：湖北省重点研发计划项目（2020BBA055）；宁夏回族自治区重点研发计划项目（2021BEF02028）；国家现代农业（肉牛/牦牛）产 -20 ℃保存备用。 对 15 只小鼠人工感染溶血性曼氏杆菌，7 d 后剖
业技术体系专项（CARS-37）
1.5 可视化LAMP检测方法的建立 杀取肺脏样本，作为实用性检测的阳性样本。另 10
刘宁宁，E-mail：673005224@qq.com
通信作者： 陈颖钰，E-mail：chenyingyu@mail.hzau.edu.cn 1）反应条件和反应体系的优化。本方法的初始反 只小鼠免疫溶血性曼氏杆菌灭活疫苗。各取 5 只分