Page 44 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第2期

第42卷 第2期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol.42 No.2
2023年 3月 Journal of Huazhong Agricultural University Mar. 2023，38~47

徐恩红，祁明普，项志杰，等.牛呼吸疾病综合征七病原联合检测多重qPCR方法的建立［J］.华中农业大学学报，2023，42（2）：38⁃47. 有数据显示，在美国的肉牛养殖场中，70%~ 牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副
DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2023.02.006 80% 的牛发病与 BRD有关，同时 BRD致死牛占总数 流感病毒 3a 基因型、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病
［4］
的 40%~50%，导致美国每年损失超过 5 亿美元 。 毒、牛冠状病毒、沙门氏菌、摩氏摩根菌、大肠杆菌、
牛呼吸疾病综合征七病原联合检测多重 在日本，农林部 2014年报告的统计数字表明，呼吸系 昏睡嗜组织杆菌（旧称为昏睡嗜血杆菌）、不动杆菌、
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统疾病占牛病的 23% 。BRD 也给我国养牛业带来 肺炎克雷伯氏菌、无乳支原体、猪链球菌、副猪嗜血
qPCR方法的建立 重大损失，主要发生在初生犊牛、断奶转群牛和经历 杆菌、乳房链球菌、停乳支原体、猪伪狂犬病毒等病
长途运输的新引进牛，但具体损失无准确数据。因 原体均由笔者所在实验室分离保存，使用前均经
徐恩红 1，2，3 ，祁明普 1，2，3 ，项志杰 1，2，3 ，胡长敏 ， 为病因复杂，诊断、治疗和预防该病的措施有限，该 PCR和测序鉴定正确。
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陈颖钰 1，2，3 ，陈建国 ，陈曦 ，郭爱珍 1，2，3，4 病尚未得到有效控制 。鉴于早期、快速和准确的诊 2）牛溶血性曼氏杆菌重组质粒。参照文献［11］
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断是有效控制该病的前提，且目前已报道的检测方
1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070； 制作重组质粒，其步骤简述如下：以牛溶血性曼氏杆
法存在检测病原数量少和操作复杂等问题 ［7-10］ ，本研
2.农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室，武汉 430070； 3.湖北洪山实验室，武汉 430070； 菌阳性核酸为模板，进行目的基因 PCR 扩增及产物
究针对 BRD最常见的 7种病原体包括牛支原体（My⁃
4.湖北省兽医流行病学国际科技合作基地/农业农村部兽用诊断制剂创制重点实验室/ 纯化回收，回收产物与 pMD19-T 载体连接，转化至
coplasma bovis，M.b）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella
农业农村部反刍动物生物制品重点实验室，武汉 430070 DH5α 感受态细胞培养，通过蓝白斑筛选，挑取单克
multocida，P.m）、牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia
隆白色菌落进行 PCR 鉴定，检测阳性的菌落送北京
摘要 为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率，以牛支原体（Mycoplasma bovis，M.b） haemolytica，M.h）、牛传染性鼻气管炎病毒（infec⁃ 擎科生物公司测序。通过序列比对，测序结果与克
oppD/F 基因、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P.m）ompH 基因、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolyt⁃ tious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛呼吸道合 隆 基 因 目 的 片 段 完 全 一 致 的 阳 性 克 隆 接 种 至
ica，M.h）gcp 基因、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）gB 基因、牛呼吸道合胞 胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、
Amp*LB 液体培养基，提取质粒。根据计算公式：质
体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）以及牛副流感病毒（bovine parainfluenza virus type，BPIV） 3型 a 牛副流感病毒 3 型 a 基因型（bovine parainfluenza vi⁃
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粒拷贝数=［6.02×10 ×质粒质量浓度（ng/μL）×
和 c基因型（BPIV-3a，-3c）的 N基因等为检测靶标，分别设计特异性引物和 Taqman探针，通过优化反应条件，采 rus type 3a，BPIV-3a）和 c 基因型（BPIV-3c），建立一
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用 3 管 7 联的组合方式建立了 7 种病原体的多联实时荧光定量 PCR 检测方法。结果显示，该方法仅对本试验的 种能够同时检测以上 7 种病原的荧光定量 PCR 检测 10 ］/（质粒碱基数×660），进行质粒拷贝数浓度
7 种病原有特异性反应，与其他常见病原无交叉反应。对 M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a 和 BPIV-3c 质 方法，以期为临床诊断 BRD 提供一种敏感、特异、多 换算，-20 ℃保存备用，作为荧光定量 PCR 的标
粒标准品的最低检测限分别为 10 、10 、10 、10 、10 、10 和 10 拷贝/μL。组内变异系数小于 2.5%，组间变异系 联、快速的病原学检测方法，为早期确诊 BRD，实施 准品。
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数小于 5.5%。平行应用该方法和常规 PCR 方法对临床采集的 115 份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测，P.m 精准治疗和防控方案、提高养殖效益，以及有效开展 牛支原体、多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎
阳性率 36.65%，M.b 阳性率 27.83%，M.h 阳性率 25.22%，IBRV 阳性率 11.30%，BPIV-3c 阳性率 8.57%，BRSV 病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒 3a和 3c基
BRD病原学和流行病学监测研究等提供理论依据。
阳性率 0.95%；其中混合感染率为 26.1%。共检测到 11种混合感染模式，主要由 M.b与其他病原体的混合感染， 因型的重组质粒均由北京擎科生物技术有限公司构
占72.7%（8/11）；M.b/P.m混合感染的检出率最高，占60%（18/30）；M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三， 1 材料与方法
建合成并完成鉴定（表1）。
其占比分别为 73.3%（22/30）、73.3%（22/30）和 43.3%（13/30）；其次为 IBRV，占 26.7%（8/30）； BPIV-3c 占
1.1 病原体、质粒及临床样品 3）临床样品。115 份牛鼻拭子均采集自 2021-
13.3%（4/30）。以上结果表明，该方法具有较高的分析敏感性和特异性，可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染
1）病原体。牛支原体、多杀性巴氏杆菌（A 型、B 2022 年间，华中地区不同牛场发生牛呼吸道疾病的
的联合检测。
型、D 型、F 型）、牛溶血性曼氏杆菌（A1 型和 A6 型）、 病牛。经常规PCR检测，58份样品为病原阳性。
关键词 多联实时荧光定量 PCR 方法； 牛呼吸疾病综合征； 混合感染； 牛支原体； 多杀性巴氏杆菌； 牛溶
表1 BRD 7种病原重组质粒信息
血性曼氏杆菌； 多病原联合检测
Table 1 Recombinant plasmids of seven BRD pathogens
中图分类号 S852.61 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2023）02-0038-10
［1］
牛 呼 吸 疾 病 综 合 征（bovine respiratory disease 等环境应激因素是该病常见的诱发因素 。BRD 可
complex，BRDC 或 BRD）是由牛支原体等多种病原 四季发生，典型症状主要为发热、精神沉郁、呼吸困
体联合作用、环境应激因素诱导下所发生的、以牛支 难、咳喘、眼分泌物增多、流涎等，急性型病例甚至出
气管肺炎为主要症状的一种牛常见传染病的总称。 现忽然倒地，口鼻流出泡沫状液体并快速死亡 ［2］ 。
BRD 在世界各地广泛流行，各品种和年龄阶段的牛 BRD 发生后可造成永久性肺损伤，使患牛生长缓慢，
均可发生，随着现代牛业集约化和专门化模式的发 更容易受到随后的环境应激因素而复发，从而降低
［3］
展而呈上升趋势，如长途运输、转群、气侯变化、分娩 养殖场的经济效益 。
1.2 主要试剂 术（北京）有限公司（TaKaRa 中国）产品；HiScript Q
收稿日期： 2022 ⁃ 11 ⁃ 01 核酸染料 Gel-red、50 bp DNA Ladder、DL 2000 Select RT SuperMix for qPCR 反转录试剂盒、Virus
基金项目：宁夏回族自治区重点研究发计划项目（2021BEF02028）；国家现代农业产业技术体系（肉牛/牦牛）专项（CARS-37）；湖北省重点 DNA/RNA Extraction Kit 2.0（Prepackaged）核酸提
DNA Marker、2×Taq Master Mix、2×T5 Fast qP⁃
研发计划项目（2020BBA055）
CR Mix（Probe）为北京擎科生物技术有限公司产品； 取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产
徐恩红，E-mail： xeh0311@163.com
通信作者： 郭爱珍，E-mail： aizhen@mail.hzau.edu.cn PrimeSTAR Max DNA Polymerase 为宝日医生物技 品，质粒小提试剂盒为 OMEGA 公司产品，凝胶回收