Page 39 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第2期

第 2 期 刘宁宁 等：牛溶血性曼氏杆菌可视化 LAMP 检测方法的建立 33

分离并保存。 应体系为 10× Isothermal Amlification Buffer 2.5 μL、
lktC 重组质粒及溶血曼氏杆菌灭活疫苗由华中 MgSO 4 （100 mmol/L） 1.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）
农业大学农业微生物资源发掘与利用全国重点实 3.5 μL、LB（10 μmol/L）1.0 μL、FIP（10 μmol/L）4.0
验室反刍动物疾病研究室构建、制备并保存。 μL、BIP（10 μmol/L）4.0 μL、F3（10 μmol/L）0.5 μL、
1.2 培养基和主要试剂 B3（10 μmol/L）0.5 μL、Bst 2.0 DNA 聚合酶（8 000
本研究所使用的 LB/Amp 培养基、LB/Amp 平 U/mL）1 μL、DNA模板1 μL以及ddH 2 O 5.5 μL。采
板培养基和 TSB 培养基均按说明书常规配制。主要 用控制变量法对反应条件和反应体系进行优化，温
试剂 Bst 2.0 DNA Polymerase、MgSO 4 、dNTPs 购自 度 分 别 以 60.6、62.5、65.0、67.0、和 68.2 ℃ 进 行 反
Bio-Rad Laboratories；Eva Green20×染料购自 Bio⁃ 应；Mg 2+ 浓度分别以 0、2、4、6、8 和 10 mmol/L 进
tium；SYBR Green I 染料、 6×Loading buffer 购自南 行反应；dNTPs 浓度分别以 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和
京诺唯赞生物有限公司。 1.6 mmol/L 进 行 反 应 ；环 引 物 分 别 以 0、0.2、0.4、
1.3 引物的设计与合成 0.6、0.8 和 1.0 μmol/L 进行反应，反应结束后 Ct 值

依据溶血性曼氏杆菌 lktC 基因序列（GenBank 越小说明反应速度越快。荧光定量 PCR 中 Ct 值最
登录号：CP017484.1）进行引物设计。包含 2 条内引 小的组对应的反应体系即为可视化 LAMP 的反应
物（FIP/BIP），2 条 外 引 物（F3/B3）和 1 条 环 引 物 条件。
（LB），引物信息如表 1 所示，引物由武汉擎科生物有 依据荧光定量 PCR 所确立的各项体系完成反应
限公司合成。
液的配制。随后在反应液上方滴加 30 µL 液体石蜡
表1 本研究中所用引物信息 进行封闭，并在反应管管盖上滴加 0.2 µL SYBR
Table 1 Primers used in this study
Green Ⅰ 染料。将反应管置于 68.2 ℃恒温水浴锅中
引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence (5′-3′)
水浴 40 min，反应结束后轻甩反应管，使染料与反应
上游内部引物 TTGTTGCAGCAGGGCAGGAGC⁃
Forward inner primer (FIP) GACCAGTTAGATAACCATAGCG 液充分混合，在自然光下观察颜色变化。如反应管
下游内部引物 AACCAGAGCGGTGGCCTCTA- 中溶液由无色变为荧光绿色则判为阳性，由无色变
Backward inner primer (BIP) AGGTGGTGTTGTTACGACTG
为橙黄色则判为阴性。
F3引物 Forward 3 (F3) CAATCGCATCCGGGCTAA
2）特异性检测。采用本文“材料与方法1.1”所述
B3引物 Backward 3 (B3) TCCGGTACGGTTCAGCAA
的 15 种病原进行特异性检测。提取该 15 种病原的
环状引物
CATCGTCTTCCGGCACAA
Loop backward (LB) DNA 作为模板，用最终优化后的反应体系分别对这
15 种病原进行检测，根据反应管中颜色的变化判断
1.4 阳性对照的制备
可视化 LAMP 的特异性。牛溶血性曼氏杆菌（A1、
1）含有 lktC基因的重组质粒的制备。在 pUC 57
A2、A6 型）菌株检测为阳性，其他病原检测为阴性即
载 体 上 插 入 lktC 基 因（GenBank 登 录 号 ：
CP017484.1）238 bp 片段，构成 lktC 基因重组质粒。 为特异性良好。

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将含有 lktC 质粒的菌液在 LB/Amp 液体培养基中 3）灵敏度检测。分别以7.9×10 ~7.9×10 -1 cop⁃
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37 ℃、180 r/min 培养 12 h，用 Omega D6943-02 质粒 ies/μL 质粒 DNA 以及 6.7×10 ~6.7×10 -4 cfu/μL
小提试剂盒提取 DNA 作为阳性对照（提取步骤参照 的细菌 DNA 为模板，双蒸水为阴性对照，进行基于
试剂盒说明书），-20 ℃保存备用。 lktC重组质粒检测的可视化 LAMP和普通 PCR的灵
2）溶血性曼氏杆菌 DNA 的制备。将溶血性曼 敏度分析，根据反应管中颜色的变化判断可视化
氏杆菌接种于 TSB 培养基中，37 ℃、180 r/min 培 LAMP 能检测质粒和细菌 DNA 的灵敏度。检测出
养 6 h；依照参考文献［3］所述方法，挑取单菌落置 来的质粒拷贝数越低，或细菌菌量越低，则表明灵敏
于 20 μL 无菌水中 ，煮沸 10 min 后冰浴 1 min，于 度越高。
10 000 r/min 离心 2 min 后吸取上清作为阳性对照， 1.6 可视化LAMP的实用性检测
-20 ℃保存备用。 对 15 只小鼠人工感染溶血性曼氏杆菌，7 d 后剖
1.5 可视化LAMP检测方法的建立 杀取肺脏样本，作为实用性检测的阳性样本。另 10
1）反应条件和反应体系的优化。本方法的初始反 只小鼠免疫溶血性曼氏杆菌灭活疫苗。各取 5 只分