Page 45 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第2期
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第 2 期               徐恩红 等：牛呼吸疾病综合征七病原联合检测多重 qPCR 方法的建立                                     39

                   有数据显示，在美国的肉牛养殖场中，70%~                        牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副
               80% 的牛发病与 BRD有关，同时 BRD致死牛占总数                     流感病毒 3a 基因型、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病
                                                          ［4］
               的 40%~50%，导致美国每年损失超过 5 亿美元 。 毒、牛冠状病毒、沙门氏菌、摩氏摩根菌、大肠杆菌、
               在日本，农林部 2014年报告的统计数字表明，呼吸系                       昏睡嗜组织杆菌（旧称为昏睡嗜血杆菌）、不动杆菌、
                                 ［5］
               统疾病占牛病的 23% 。BRD 也给我国养牛业带来                       肺炎克雷伯氏菌、无乳支原体、猪链球菌、副猪嗜血
               重大损失，主要发生在初生犊牛、断奶转群牛和经历                          杆菌、乳房链球菌、停乳支原体、猪伪狂犬病毒等病
               长途运输的新引进牛，但具体损失无准确数据。因                           原体均由笔者所在实验室分离保存，使用前均经
               为病因复杂，诊断、治疗和预防该病的措施有限，该                          PCR和测序鉴定正确。
                                 ［6］
               病尚未得到有效控制 。鉴于早期、快速和准确的诊
                                                                    2）牛溶血性曼氏杆菌重组质粒。参照文献［11］
               断是有效控制该病的前提，且目前已报道的检测方
                                                                制作重组质粒，其步骤简述如下：以牛溶血性曼氏杆
               法存在检测病原数量少和操作复杂等问题                   ［7-10］ ，本研  菌阳性核酸为模板，进行目的基因 PCR 扩增及产物
               究针对 BRD最常见的 7种病原体包括牛支原体（My⁃                      纯化回收，回收产物与 pMD19-T 载体连接，转化至
               coplasma bovis，M.b）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella          DH5α 感受态细胞培养，通过蓝白斑筛选，挑取单克
               multocida，P.m）、牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia
                                                                隆白色菌落进行 PCR 鉴定，检测阳性的菌落送北京
               haemolytica，M.h）、牛传染性鼻气管炎病毒（infec⁃
                                                                擎科生物公司测序。通过序列比对，测序结果与克
               tious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛呼吸道合
                                                                隆 基 因 目 的 片 段 完 全 一 致 的 阳 性 克 隆 接 种 至
               胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、
                                                                Amp*LB 液体培养基，提取质粒。根据计算公式：质
               牛副流感病毒 3 型 a 基因型（bovine parainfluenza vi⁃
                                                                                   23
                                                                粒拷贝数=［6.02×10 ×质粒质量浓度（ng/μL）×
               rus type 3a，BPIV-3a）和 c 基因型（BPIV-3c），建立一
                                                                10 ］/（质粒碱基数×660），进行质粒拷贝数浓度
                                                                  -9
               种能够同时检测以上 7 种病原的荧光定量 PCR 检测
               方法，以期为临床诊断 BRD 提供一种敏感、特异、多                       换算，-20 ℃保存备用，作为荧光定量 PCR 的标
               联、快速的病原学检测方法，为早期确诊 BRD，实施                        准品。
               精准治疗和防控方案、提高养殖效益，以及有效开展                              牛支原体、多杀性巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎
               BRD病原学和流行病学监测研究等提供理论依据。                          病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒 3a和 3c基
                                                                因型的重组质粒均由北京擎科生物技术有限公司构
               1 材料与方法
                                                                建合成并完成鉴定（表1）。
               1.1 病原体、质粒及临床样品                                      3）临床样品。115 份牛鼻拭子均采集自 2021-

                   1）病原体。牛支原体、多杀性巴氏杆菌（A 型、B                     2022 年间，华中地区不同牛场发生牛呼吸道疾病的
               型、D 型、F 型）、牛溶血性曼氏杆菌（A1 型和 A6 型）、 病牛。经常规PCR检测，58份样品为病原阳性。
                                                 表1 BRD 7种病原重组质粒信息
                                        Table 1 Recombinant plasmids of seven BRD pathogens
                     病原            基因登录号                靶基因            载体       插入片段大小(bp)及在靶基因中位置(nt)
                   Pathogens      Accession number    Target genes    Vectors      Insert fragment size and position
                    M.b            CP042939.1          OPPD\F        pMD18T              191（66~256）
                    P.m            CP033600.1           ompH         pMD18T             183（329~511）
                    M.h            CP017484.1            GCP         pMD18T             171（247~417）
                    IBRV           MG407785.1            gB          pMD18T            118（1 486~1 603）
                    BRSV           AF054664.1             N          pMD18T             149（585~733）
                    BPIV-3a        MH552577.1             N          pMD18T            153（1 322~1 474）
                    BPIV-3c        LC040886.1             N           pUC57             1548（1~1 548）
               1.2 主要试剂                                         术（北京）有限公司（TaKaRa 中国）产品；HiScript Q

                   核酸染料 Gel-red、50 bp DNA Ladder、DL 2000        Select RT SuperMix for qPCR 反转录试剂盒、Virus
               DNA  Marker、2×Taq  Master  Mix、2×T5  Fast  qP⁃   DNA/RNA Extraction Kit 2.0（Prepackaged）核酸提
               CR Mix（Probe）为北京擎科生物技术有限公司产品； 取试剂盒为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产
               PrimeSTAR Max DNA Polymerase 为宝日医生物技             品，质粒小提试剂盒为 OMEGA 公司产品，凝胶回收
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