Page 40 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第1期

第42卷 第1期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol.42 No.1
2023年 1月 Journal of Huazhong Agricultural University Jan. 2023，34~41

利用全波长扫描酶标仪（Thermo Fisher）和 1% 琼脂 PCR 扩增，PCR 反应条件为：98 ℃变性 10 s，61 ℃退
屠凯，文晓鹏，张惠敏，等.火龙果HpGST基因克隆及表达分析［J］.华中农业大学学报，2023，42（1）：34‐41.
DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2023.01.005 糖凝胶电泳检测总 RNA 的浓度和质量；利用 TaKa‐ 火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环 ；72 ℃延伸 10
Ra 公司反转录试剂盒（PrimeScript TM TR reagent Kit min；4 ℃ 保 存 。 扩 增 采 用 10 μL 体 系 ，包 括 5 μL
火龙果HpGST基因克隆及表达分析 with gDNA Eraser）进行反转录，合成cDNA第1链。 PrimerSTAR Buffer、3.5 μL ddH 2 O、0.5 μL 正 向 引
1.3 基因克隆 物、0.5 μL反向引物、0.5 μL cDNA 模板。产物用 1%
屠凯，文晓鹏，张惠敏，申洛男 根据 HpGST 基因序列，使用 Prism 5.0本地软件 琼脂糖凝胶电泳检测后，目的片段胶回收后与 Blunt

设 计 特 异 性 引 物（表 1）。 利 用 PrimeSTAR HS 克隆载体连接并转化大肠杆菌感受态中，送生工生
贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/
DNA Polymerase （TaKaRa， 大 连）高 保 真 酶 进 行 物工程（上海）股份有限公司测序。
山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室，贵阳 550025
表1 火龙果HpGST基因克隆的相关引物。
Table 1 Primers used for HpGST gene cloning in pitaya fruit
摘要 为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽 S-转移酶基因（HpGST）的功能，克隆了 HpGST 基因的 cDNA
序列，并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST 序列全长为 666 bp，编码 221 个氨基酸，编码蛋白属于
非分泌型不稳定亲水性蛋白，亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用；系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近，
属谷胱甘肽转移酶 Tau 家族；实时荧光定量 PCR 分析结果显示，HpGST 在火龙果不同色泽类型品种果肉中均
有表达，在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型，表达趋势均为先上升后
下降，其表达量与甜菜素含量呈现正相关，且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致，推测
HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。
关键词 火龙果； 谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）； 甜菜素； 生物信息学； 基因克隆
中图分类号 S667.903 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2023）01-0034-08
1.4 基因生物信息学分析 2 结果与分析

谷胱甘肽 S-转移酶（GSTs）是一种普遍存在的 cDNA 全长序列，分析 HpGST 在火龙果不同组织和 利用美国国家生物技术信息中心（National Cen‐ 2.1 HpGST基因克隆与生物信息学分析
参与多种细胞功能的蛋白，参与植物花青苷运输与 发育时期的表达情况，测定相应时期和组织中甜菜 ter for Biotechnology Information，NCBI）进行核苷酸
将 提 取 的 火 龙 果 总 RNA 反 转 录 获 得 火 龙
定位。花青素的运输需要与GSH结合才能运输到液 素含量，进而对该基因表达与甜菜素含量间的相关 和氨基酸序列比对及保守结构域分析；使用 MEGA
cDNA，以火龙果 cDNA 为模板，利用引物 HPGST-F
泡中，而谷胱甘肽泵能够识别与 GSH 结合标记的内 性进行分析，旨在全面认识 HpGST 基因在火龙果甜 8.0 软 件 构 建 系 统 发 育 树 ；使 用 Expasy（https：//
和 HPGST-R（表 1）扩增得到 1 条 500~900 bp 的特
源底物并将它们定位到合适部位 ［1］ 。在苹果中， 菜素代谢过程中的分子机制， 为通过基因工程手段 www.expasy.org/resources/protparam）在线分析软件
异性条带。利用 ExPaSy-Protparam 预测 HpGST 蛋
MdGSTF3 基因的表达与果实不同组织花青苷的积 对果实色泽性状进行定向改良提供新信息。 预测蛋白质的理化性质和亲疏水性；TMHMM Serv‐ 白分子质量为 2.5 ku，理论等电点为 7.02。编码氨基
［2］
累和分布密切相关 。在葡萄中，葡萄果皮和果肉花 1 材料与方法 er2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？
［3］
青苷的积累与 GST 相关 ，GST 参与小泡运输花青 TMHMM-2.0）在线软件分析蛋白质的跨膜结构域； 酸包含了 20 种常见氨基酸。其中赖氨酸含量最高，
［4］
苷 ，并且在葡萄中，葡萄 ATP 结合蛋白 ABCC1 运 1.1 试验材料 使用 Cell-PLoc 2（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bio‐ 达到10%。分子式为C 1193 H 1834 N 304 O 326 S 7 。蛋白不稳
［5］
输花青苷依赖于谷胱甘肽的含量 。 选取贵州省罗甸县火龙果种植基地紫肉（紫 inf/Cell-PLoc-2/）预测蛋白质的亚细胞定位，GOR4 定系数为 44.46，属于不稳定蛋白。利用 TMHMM-
火龙果（Hylocereus）为仙人掌科（Cactaceae）量 红龙）、粉肉（粉红龙）、白肉（晶红龙）类型适龄植 2.0分析跨膜结构域，发现该蛋白不具有跨膜结构域，
（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl） 推测其在膜外发挥作用。利用在线分析软件 Cell-
天尺属（Hylocereusundatus）果树，因其富含甜菜素而 株挂牌标记，每种色泽类型品种选 3 株，采集开花
预测蛋白质二级结构。 PLoc 2.0分析蛋白的亚细胞定位，发现该基因主要定
具有很高的经济价值，被贵州省列为重点支持的特 后 10 、20 、25 、26 、27 、30 d 果 实 ，并 分 别 标 记 为
1.5 RT-PCR分析
色产业 ［6］ 。研究表明，甜菜素是以酪氨酸为起始底 S1（10 DAF）、S2（20 DAF）、S3（25 DAF）、S4（26 DAF）、 位于细胞质。利用 ExPASy 的 ProtScale 程序分析火
根据笔者所在课题组前期获得的火龙果转录组 龙果 HpGST 编码蛋白疏水性和亲水性，结果显示，
物，经众多酶促反应和自发反应合成，其关键酶是酪 S5（27 DAF）、S6（30 DAF）。每个采样时期从 3株植
数据 ［8］ 中的 HpGST 基因序列，设计荧光定量引物， 该蛋白质属于亲水性蛋白。通过 GOR 4在线分析软
［7］
氨酸羟化酶和 4，5-多巴双加氧酶 。虽然甜菜素合 株各采 1 果，经清水洗净后液氮速冻，并置于-80 ℃
qHpGST-F和 qHpGST-R（表 1），以 ACTION-2为内
成通路日渐清晰，对于甜菜素合成后的运输机制尚 超低温冰箱备用。 件对 HpGST 蛋白进行二级结构预测，其中 α-螺旋占
参，分别设计其特异性引物 ACTION-2-F、ACTION 该蛋白的比例最高为 33.94%，不规则卷曲所占比例
不清楚。火龙果的主要色素是甜菜素而不是花青 1.2 总RNA提取与cDNA合成
2-R（表1），采用2 -△△Ct 法分析相对表达量。 为46.15%，延伸链所占比例为19.91%（图1）。
素，鉴于GST在植物中参与花青苷运输与定位的重要 取约 0.2 g 样品经液氮速冻充分研磨后，采用多
1.6 甜菜素提取和测定 使用 NCBI 的 CDD 在线分析软件对 HpGST 进
作用，火龙果GST是否参与甜菜素的运输与定位？为 糖多酚植物 RNA 提取试剂盒（张家口赛诺生物科技
［9］
参考曾灿彬 的方法并进行改进。准确称取不 行蛋白质保守结构域预测，结果（图 2）显示，该基因
探究这一科学问题，本研究克隆火龙果HpGST基因的 有限公司），根据说明书操作步骤提取果实总 RNA，
同色泽类型品种及不同发育时期火龙果果肉 0.2 g， 编码蛋白含有 GST_N_Tau 和 GST_C_Tau 的保守
收稿日期： 2022 ‐ 07 ‐ 28 经液氮研磨，利用 80% 乙醇提取甜菜素，在紫外分光 结构域，第 1 个保守结构域由第 6~80 个氨基酸之间
基金项目：国家自然科学基金项目（32060663）；贵州省教育厅普通高等学校科技拔尖人才项目（黔教合KY字［2021］028）
光度计上分别于波长 538、470 nm 处测定甜菜红素和 的 74 个氨基酸组成，第 2 个保守结构域由第 91~214
屠凯，E-mail：2535170385@qq.com
通信作者： 文晓鹏，E-mail： xpwensc@hotmail.com 甜菜黄素吸光度并计算其含量。 个氨基酸之间的 123个氨基酸组成，并将该编码蛋白