Page 41 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第1期
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第 1 期                        屠凯 等：火龙果 HpGST 基因克隆及表达分析                                      35

               利用全波长扫描酶标仪（Thermo Fisher）和 1% 琼脂                 PCR 扩增，PCR 反应条件为：98 ℃变性 10 s，61 ℃退
               糖凝胶电泳检测总 RNA 的浓度和质量；利用 TaKa‐                     火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环 ；72 ℃延伸 10
               Ra 公司反转录试剂盒（PrimeScript        TM  TR reagent Kit   min；4 ℃ 保 存 。 扩 增 采 用 10 μL 体 系 ，包 括 5 μL
               with gDNA Eraser）进行反转录，合成cDNA第1链。                PrimerSTAR Buffer、3.5 μL ddH 2 O、0.5 μL 正 向 引
               1.3 基因克隆                                         物、0.5 μL反向引物、0.5 μL cDNA 模板。产物用 1%

                   根据 HpGST 基因序列，使用 Prism 5.0本地软件               琼脂糖凝胶电泳检测后，目的片段胶回收后与 Blunt
               设 计 特 异 性 引 物（表 1）。 利 用  PrimeSTAR  HS           克隆载体连接并转化大肠杆菌感受态中，送生工生
               DNA  Polymerase （TaKaRa，  大 连）高 保 真 酶 进 行        物工程（上海）股份有限公司测序。
                                              表1 火龙果HpGST基因克隆的相关引物。
                                      Table 1 Primers used for HpGST gene cloning in pitaya fruit

                     引物名称 Primer name         引物序列（5′-3′） Primer sequence（5′-3′）          用途 Usage
                         HpGST-F              CGGAATCCAGAAACCCGTGTG                   HpGST基因cDNA扩增
                         HpGST-R              GCAACACTCAAGGCGTTAGCT               Amplification of HpGST gene cDNA
                         qHpGST-F             TGCTGATTCACAACAACCGTCCG                    基因表达分析
                         qHpGST-R             TGCCTCCTGCTCTTCACCCT                   Analysis of gene expression
                         ACTION-2-F           TCCCGAAGAGCACCCAGTTT                        内参基因
                         ACTION-2-R           ATGGCATGAGGAAGGGCATA                       Reference gene
               1.4 基因生物信息学分析                                    2 结果与分析

                   利用美国国家生物技术信息中心（National Cen‐
                                                                2.1 HpGST基因克隆与生物信息学分析
               ter for Biotechnology Information，NCBI）进行核苷酸
                                                                    将 提 取 的 火 龙 果 总 RNA 反 转 录 获 得 火 龙
               和氨基酸序列比对及保守结构域分析；使用 MEGA
                                                                cDNA，以火龙果 cDNA 为模板，利用引物 HPGST-F
               8.0  软 件 构 建 系 统 发 育 树 ；使 用 Expasy（https：//
                                                                和 HPGST-R（表 1）扩增得到 1 条 500~900 bp 的特
               www.expasy.org/resources/protparam）在线分析软件
                                                                异性条带。利用 ExPaSy-Protparam 预测 HpGST 蛋
               预测蛋白质的理化性质和亲疏水性；TMHMM Serv‐
                                                                白分子质量为 2.5 ku，理论等电点为 7.02。编码氨基
               er2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？
                                                                酸包含了 20 种常见氨基酸。其中赖氨酸含量最高，
               TMHMM-2.0）在线软件分析蛋白质的跨膜结构域；
                                                                达到10%。分子式为C 1193 H 1834 N 304 O 326 S 7 。蛋白不稳
               使用 Cell-PLoc 2（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bio‐
                                                                定系数为 44.46，属于不稳定蛋白。利用 TMHMM-
               inf/Cell-PLoc-2/）预测蛋白质的亚细胞定位，GOR4
                                                                2.0分析跨膜结构域，发现该蛋白不具有跨膜结构域，
              （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl）  推测其在膜外发挥作用。利用在线分析软件 Cell-
               预测蛋白质二级结构。
                                                                PLoc 2.0分析蛋白的亚细胞定位，发现该基因主要定
               1.5 RT-PCR分析
                                                                位于细胞质。利用 ExPASy 的 ProtScale 程序分析火
                   根据笔者所在课题组前期获得的火龙果转录组
                                                                龙果 HpGST 编码蛋白疏水性和亲水性，结果显示，
               数据  ［8］ 中的 HpGST 基因序列，设计荧光定量引物，                  该蛋白质属于亲水性蛋白。通过 GOR 4在线分析软
               qHpGST-F和 qHpGST-R（表 1），以 ACTION-2为内             件对 HpGST 蛋白进行二级结构预测，其中 α-螺旋占
               参，分别设计其特异性引物 ACTION-2-F、ACTION                   该蛋白的比例最高为 33.94%，不规则卷曲所占比例
               2-R（表1），采用2    -△△Ct 法分析相对表达量。                   为46.15%，延伸链所占比例为19.91%（图1）。
               1.6 甜菜素提取和测定                                         使用 NCBI 的 CDD 在线分析软件对 HpGST 进
                             ［9］
                   参考曾灿彬 的方法并进行改进。准确称取不                         行蛋白质保守结构域预测，结果（图 2）显示，该基因
               同色泽类型品种及不同发育时期火龙果果肉 0.2 g， 编码蛋白含有 GST_N_Tau 和 GST_C_Tau 的保守
               经液氮研磨，利用 80% 乙醇提取甜菜素，在紫外分光                       结构域，第 1 个保守结构域由第 6~80 个氨基酸之间
               光度计上分别于波长 538、470 nm 处测定甜菜红素和                    的 74 个氨基酸组成，第 2 个保守结构域由第 91~214
               甜菜黄素吸光度并计算其含量。                                   个氨基酸之间的 123个氨基酸组成，并将该编码蛋白
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