Page 46 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第2期
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40                                 华 中 农 业 大 学 学 报                                    第 42 卷

               试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品。琼脂                              表2 用于BRD 7种病原qPCR扩增的引物探针
               粉、氨苄青霉素为 Ameresco 公司产品；NaCl 为国药                   Table 2 Primers and probes of each BRD pathogen for
               集团化学试剂有限公司产品。                                                   qPCR amplification
               1.3 引物探针设计与合成                                     引物名称              序列5´→3´          产物大小/bp
                                                                Primer names     Sequences 5´→3´     Product size
                   从 GenBank 中批量下载 M.b、P.m、M.h、IBRV、
                                                                 M.b-F    TCGCATAACATTAGTGTTGTCG
               BRSV 和 BPIV-3 的基因组序列，用 MEGA7 进行序
                                                                 M.b-R    TCTGGTGGGGTTCCTTGA
               列比对，挑选序列多样性低的区域，作为目的扩增区                                    FAM-CTCATCATCATTTTCAGG⁃      145
                                                                 M.b-P
               域。此外，根据核酸相似性，挑选能代表该病原多数                                    TATAGCCGAGAT-BHQ1
               基因的序列作为参考序列。经序列比对，发现BPIV-                         P.m-F    GCGAGCAAGAAGCGATCA
               3 不同基因型间的核酸相似性低，无法满足引物和探                          P.m-R    CGACTGCACCTTCATTCAGTAC       183
                                                                          Texas Red-TACCGCGTTTTGAAT⁃
               针的设计，因此挑选在中国流行较多的 BPIV-3a 和                       P.m-P
                                                                          GCTATCCACT-BHQ2
               BPIV-3c的基因序列，分别进行序列比对及引物和探
                                                                 M.h-F    TTGCTCTAACGCTCGCTTG
               针 的 设 计 。 最 终 ，以 M. b（CP042939）、P. m              M.h-R    GGACTGGATTTCAGTTTCTCC
                                                                                                       171
              （CP033600）、M.h（CP017484）、IBRV（MG407785）、                    HEX-CCAACAAGCCGTGGTT⁃
                                                                 M.h-P
               BRSV（AF054664）、BPIV-3a（MH552577）和 BPIV-                    GATACTATTTT-BHQ1
                                                                 IBRV-F   AGCACCTTTGTGGACCTAA
               3c（LC040886）作为参考序列，设计 7种病原的特异性
                                                                 IBRV-R   GCTGTATCTCGCTGTAGTCG
               引物及相应的 TaqMan 探针（表 2），用于扩增 M.b 的                                                        118
                                                                          CY5-CCGCGAGTTCTTGCCGC⁃
               oppD/F 基因，M.h 的 GCP 基因，P.m 的 ompH 基因，             IBRV-P   TAGAAGTGT-BHQ2
               IBRV的gB基因，BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c的N基                 BRSV-F   ACGATACAAAGGACTTATCCCA
               因。引物探针均由北京擎科生物技术有限公司合成。                           BRSV-R   CTGCAAAGATTCCTTCTACCC
                                                                                                       149
               1.4 反应条件的优化及标准曲线的建立                                        CY5.5-ATTTTGGCATTGCT⁃
                                                                 BRSV-P
                                                                          CAATCCTCAAC-BHQ2
                   本研究所涉及的 7 种病原均以 10  copies/μL 质
                                                 6
                                                                 BPIV-3a-F  CATCCATAGTTCCTTATGCATG
               粒 DNA 为模板，采用控制变量法，对引物浓度 1~
                                                                 BPIV-3a-R  TTGGGTCGCTCTGTTTCC
               4.5 pmol/μL，探针浓度 0.5~4.0 pmol/μL，退火温度                                                   153
                                                                          Texas Red-CGTTGAGTCTTTT⁃
                                                                 BPIV-3a-P
               57~64 ℃，各分为 8 个梯度进行优化，以 Ct 值大小、                            GTTCAGCCTGTCTCT-BHQ2
               荧光信号高低和扩增曲线变化为依据，确定最佳的                            BPIV-3c-F  ACAGTATGTAACAGGACGGTCC
               反应条件。                                             BPIV-3c-R  GCCTCTTGTGTAATCCCCAA       126
               1.5 特异性试验                                         BPIV-3c-P  HEX-TGCCACTGCTT⁃
                                                                          GACCTAGTTGGAAC-BHQ1
                   提取牛常见病原体包括昏睡嗜组织杆菌、摩氏
               摩根菌、停乳链球菌、无乳支原体、猪链球菌、副猪嗜                         1.7 重复性试验
               血杆菌、伪狂犬病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病                             将 7 种病原的靶基因质粒 DNA 进行 10 倍系列
               毒性腹泻病毒、牛副流感病毒 3a型、牛副流感病毒 3c                      稀释，以不同浓度的质粒 DNA 为模板，进行 3次批内
               型、牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒                           和批间试验，用所得 Ct 值计算出平均 Ct 值、标准差
               DNA 或 cDNA，并以此为模板，双蒸水为阴性对照， 和变异系数，分析多联qPCR方法的重复性。
               采用优化后的最佳反应体系条件，进行多联 qPCR 体                       1.8 临床样品检测
               系检测方法的特异性分析，本研究所涉及的 7种特定                             将实验室保存的临床病牛的鼻拭子反复冻融 3
               病原的核酸用作阳性对照。                                     次，随后结合 EasyPure Viral DNA/RNA 病毒核酸提
               1.6 敏感性试验                                        取 试 剂 盒 和 VAMNE Magnetic Pathogen DNA Kit
                   将本研究所涉及的7种病原的质粒DNA进行10 （Prepackaged）细菌核酸提取试剂盒说明书步骤，把
               倍系列稀释，以不同浓度的质粒 DNA 为模板，分别                        样本放置于核酸自动提取仪中提取。提取的病毒基
               将 7 种病原质粒 DNA 加入对应多重体系中，按照优                      因 组 核 酸 按 照 HiScript  Q  Select  RT  SuperMix  for

               化后的最佳反应体系条件，在相同条件下进行 qPCR                        qPCR 反转录试剂盒对病毒 RNA 反转录。采用所建
               扩增，双蒸水为阴性对照进行质粒的敏感性分析。                           立的多联荧光定量 PCR 方法及常规 PCR 方法对样
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