Page 31 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第2期

第 2 期 王宇 等：山羊痘弱毒疫苗 （AV41 株） 接种途径和剂量对牛抗体反应的影响 25

LSD 疫情的湖北良友金牛畜牧科技有限公司，牛群 剂量与接种途径共设置 A、B、C、D、E（对照组）5 组，
临床上无临床可见异常，健康状况良好，利用 PCR 检 每组 5 头牛。A、B 组分别接种 5 头份羊剂量，C、D 组
测与血清抗体检测证实没有 LSDV 感染。按照免疫 分别接种10头份羊剂量，疫苗接种详细方案见表1。
表1 山羊痘病毒弱毒疫苗接种牛体实验方案
Table 1 Experimental protocol for inoculation of attenuated goat pox vaccine in cattle

组别 数量 接种剂量 # 接种方式 接种部位 稀释体积/mL
Group Number Inoculation dose Inoculation route Inoculation place Dilution volume
A 5 5×10 3.5 TCID 50 皮下接种 Subcutaneous 颈部 Neck 1.0
3.5
B 5 5×10 TCID 50 皮内接种 Intradermal 尾根 Tail head 1.0
C 5 10×10 3.5 TCID 50 皮下接种 Subcutaneous 颈部 Neck 1.0
D 5 10×10 3.5 TCID 50 皮内接种 Intradermal 尾根 Tail head 1.0
E 5 生理盐水Normal saline 皮下接种 Subcutaneous 颈部 Neck 1.0
注：#：标准 1 头份羊剂量含量≥1.0×10 3.5 TCID 50 AV41 株；TCID 50 ：半数组织培养物感染剂量。Note：#：Standard one goat dose ≥
3.5
1.0 × 10 TCID 50 AV41 strain； TCID 50 ：Median tissue culture infective dose.
1.2 疫苗 1.5 免疫后抗体反应监测
山羊痘弱毒活疫苗（CVCC，AV41 株）购自吉林 分别采用法国 IDVet 公司生产的双抗原夹心
®
正业生物制品股份有限公司。使用前按产品要求将 ELISA 试剂盒（ID Screen Capripox Double Antigen
疫苗保存于-20 ℃条件下。免疫前使用无菌生理盐 Multi-species ELISA Kit，No. CPVDA-5P）以及病毒
水对疫苗冻干粉进行对应浓度的稀释，当日即配 细胞中和试验法测定抗体。试剂盒由深圳市青珊瑚
即用。 科技有限公司馈赠。ELISA 抗体检测按该试剂盒说
1.3 样品采集与处理 明书进行操作并对结果进行解读，S/P值大于或等于

接种疫苗后每日观察试验牛只精神状态、食欲 30%判定为阳性，S/P值小于30%判定为阴性。
病毒中和试验（virus neutralisation test，VNT）按
和体表情况，并分别于免疫后第 0、15、30、45、60天采
照文献［3］的操作步骤进行，首先对血清样品从 1∶5
集所有实验动物的血液和鼻咽拭子样品。每头动物
倍开始，进行 2 倍系列稀释至 640 倍，共 8 个稀释度。
通过尾根静脉采集约 10 mL 血液，5 mL 血液置于无
使用 Vero 细胞和已滴定毒价的山羊痘弱毒活疫苗
菌真空管中，室温下放置 2~3 h，随后 3 000 r/min 离
（AV41 株）对待检血清进行检测，阴阳性对照血清为
心 10 min 提取血清，-20 ℃条件下保存直至检测。
事先滴定的已知背景血清。从第 4 天起开始观测每
另外 5 mL 血液置于 EDTA 抗凝管中用于检测是否
个细胞孔中细胞病变情况（CPE），连续观测至第 9
存在病毒血症。棉签用无菌生理盐水浸润，之后采
天。检测结果按中和指数（neutralisation index，NI）
集鼻咽拭子，置于 3~4 mL 生理盐水溶液中，及时送
进行判定，NI 为阴性血清和试验血清中病毒滴度之
回实验室放置于-80 ℃保存。全血和鼻咽拭子经过
间的对数滴度差，NI≥1.5 判定为阳性，NI<1.5 判定
反复冻融3次后用于提取核酸，作为PCR模板。
为阴性 ［3］ ；同时利用 Reed-Muench 方法计算血清中
1.4 PCR检测 ［9］
和抗体滴度 ，抗体稀释度≥1∶20 判定为阳性，<1∶
将处理好的鼻咽拭子以及全血样品，按照北
20则为阴性。
®
京全式金病毒 DNA 提取试剂盒（EasyPure Viral 1.6 统计分析
DNA Kit，No.ER201）说明书进行病毒核酸提取。 本研究所有数据存储于 Excel 表格中，随后导入
采用《WOAH 陆生动物诊断试验和疫苗手册》推荐 R 软 件（version 4.1.2，R Development Core Team，
PCR 方法扩增 LSDV 核酸 ［3，8］ 。PCR针对的靶基因 2022）进行数据分析和可视化。检测方法之间的符
是 LSDV074 基因中一段保守序列，扩增产物片段的 合率、敏感性、特异性、阳性和阴性预测率采用 Dohoo
大小为 192 bp。引物序列如下：Forward primer 5′ 等 ［10］ 的介绍计算；利用皮尔逊相关性检验（Pearson’s
-TCC-GAG-CTC-TTT-CCT-GAT-TTT-TCT- correlation）对 NI与 log 10 转换的 S/P 值进行相关性分
TAC-TAT-3′，Reverse primer 5′-TAT-GGT-ACC- 析。由于存在较多阴性抗体 NI 值为 0 的干扰，去除
TAA-ATT-ATA-TAC-GTA-AAT-AAC-3′。 引 NI 值为 0 的样品后进行简单线性回归拟合。epiR
物由北京擎科生物科技有限公司（武汉分公司）合成。 包 ［11］ 用于计算以上各参数及其 95% 置信区间（confi⁃