Page 30 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第2期

第42卷 第2期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol.42 No.2
2023年 3月 Journal of Huazhong Agricultural University Mar. 2023，24~31

LSD 疫情的湖北良友金牛畜牧科技有限公司，牛群 剂量与接种途径共设置 A、B、C、D、E（对照组）5 组，
王宇，熊博，彭清洁，等.山羊痘弱毒疫苗（AV41株）接种途径和剂量对牛抗体反应的影响［J］.华中农业大学学报，2023，42（2）：24⁃31.
DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2023.02.004 临床上无临床可见异常，健康状况良好，利用 PCR 检 每组 5 头牛。A、B 组分别接种 5 头份羊剂量，C、D 组
测与血清抗体检测证实没有 LSDV 感染。按照免疫 分别接种10头份羊剂量，疫苗接种详细方案见表1。
山羊痘弱毒疫苗（AV41株）接种途径 表1 山羊痘病毒弱毒疫苗接种牛体实验方案
Table 1 Experimental protocol for inoculation of attenuated goat pox vaccine in cattle
和剂量对牛抗体反应的影响

王宇 ，熊博 ，彭清洁 ，项志杰 ，袁歆玮 ，
1，2
1，2
3
1，2
1，2
王艳 ，邹良勋 ，陈颖钰 ，郭爱珍 1，2
1
4
1，2
1.华中农业大学动物医学院/农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室，武汉 430070；
2.湖北洪山实验室，武汉 430070； 3.安琪酵母股份有限公司，宜昌 443001；
注：#：标准 1 头份羊剂量含量≥1.0×10 3.5 TCID 50 AV41 株；TCID 50 ：半数组织培养物感染剂量。Note：#：Standard one goat dose ≥
4.湖北良友金牛畜牧科技有限公司，襄阳 441034
3.5
1.0 × 10 TCID 50 AV41 strain； TCID 50 ：Median tissue culture infective dose.
摘要 为评估山羊痘弱毒疫苗（AV41 株）经皮下和皮内接种牛体后的抗体产生规律，优化牛体免疫程序， 1.2 疫苗 1.5 免疫后抗体反应监测
选取 25 头健康成年肉牛分为 5 组，每组 5 头，标准单头份剂量为含量 1.0 × 10 TCID 50 AV41 株，分别以 5 倍和 山羊痘弱毒活疫苗（CVCC，AV41 株）购自吉林 分别采用法国 IDVet 公司生产的双抗原夹心
3.5
®
10 倍羊用剂量进行皮下和皮内免疫，于接种后 0、15、30、45 和 60 d，利用病毒中和试验（VNT）和 ELISA 试剂盒 正业生物制品股份有限公司。使用前按产品要求将 ELISA 试剂盒（ID Screen Capripox Double Antigen
检测血清抗体水平。结果显示：鼻咽拭子和血液 PCR结果均为阴性，未出现排毒；VNT与 ELISA抗体检测结果 Multi-species ELISA Kit，No. CPVDA-5P）以及病毒
疫苗保存于-20 ℃条件下。免疫前使用无菌生理盐
相似，免疫后第 30 天，皮下接种 5 倍剂量组中有 60% 牛抗体转阳，中和抗体滴度最高达 1∶640。同时，皮内和皮
水对疫苗冻干粉进行对应浓度的稀释，当日即配 细胞中和试验法测定抗体。试剂盒由深圳市青珊瑚
下 10 倍剂量组各有 40% 牛抗体转阳，皮内 5 倍剂量组有 20% 牛抗体转阳。VNT 中和指数与 ELISA 的 S/P 值
即用。 科技有限公司馈赠。ELISA 抗体检测按该试剂盒说
呈现显著正相关。上述结果表明，类似于国际上相关疫苗的接种途径和剂量，皮下注射 5 倍羊头份剂量山羊痘 明书进行操作并对结果进行解读，S/P值大于或等于
弱毒疫苗是安全和有效的，可作为临床预防牛结节皮肤病的免疫接种方案。 1.3 样品采集与处理
关键词 牛结节性皮肤病； 山羊痘弱毒疫苗（AV41株）； 免疫剂量； 免疫途径； 抗体监测； 健康养殖 接种疫苗后每日观察试验牛只精神状态、食欲 30%判定为阳性，S/P值小于30%判定为阴性。
+
中图分类号 S852.65 3 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2023）02-0024-08 和体表情况，并分别于免疫后第 0、15、30、45、60天采 病毒中和试验（virus neutralisation test，VNT）按
照文献［3］的操作步骤进行，首先对血清样品从 1∶5
集所有实验动物的血液和鼻咽拭子样品。每头动物
牛结节性皮肤病（lumpy skin disease，LSD），又 山羊痘和绵羊痘病毒与 LSDV 同属山羊痘病毒 通过尾根静脉采集约 10 mL 血液，5 mL 血液置于无 倍开始，进行 2 倍系列稀释至 640 倍，共 8 个稀释度。
称牛结节疹、牛结节性皮肤炎或牛疙瘩皮肤病，该病 属病毒，基因组高度同源，抗原的相似性很高，具有 菌真空管中，室温下放置 2~3 h，随后 3 000 r/min 离 使用 Vero 细胞和已滴定毒价的山羊痘弱毒活疫苗
是由痘病毒科、山羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒 交叉保护作用，因此，国际上常使用山羊痘与绵羊痘 心 10 min 提取血清，-20 ℃条件下保存直至检测。 （AV41 株）对待检血清进行检测，阴阳性对照血清为
（LSD virus，LSDV）引起的一种牛的传染性疾病。 弱毒疫苗控制 LSD 。农业农村部在《牛结节性皮 事先滴定的已知背景血清。从第 4 天起开始观测每
［7］
发病牛主要以发热、全身性皮肤、黏膜和内脏出现结 肤病防治技术规范》中规定，采用皮内注射 5 头份羊 另外 5 mL 血液置于 EDTA 抗凝管中用于检测是否 个细胞孔中细胞病变情况（CPE），连续观测至第 9
［1］
节性病灶为主要特征 ，造成牛产奶量下降、生长发 剂量的山羊痘弱毒活疫苗对风险地区进行全群牛紧 存在病毒血症。棉签用无菌生理盐水浸润，之后采 天。检测结果按中和指数（neutralisation index，NI）
育受阻、母牛流产、公牛短暂性或终身性不育、皮革 集鼻咽拭子，置于 3~4 mL 生理盐水溶液中，及时送
急 免 疫（http：//www. moa. gov. cn/nybgb/2020/ 进行判定，NI 为阴性血清和试验血清中病毒滴度之
损伤，甚至死亡，对养牛业产生了重大经济影响 ［2］ 。 回实验室放置于-80 ℃保存。全血和鼻咽拭子经过
202008/202010/t20201020_6354665. htm）。 但 临 床 间的对数滴度差，NI≥1.5 判定为阳性，NI<1.5 判定
该病被世界动物卫生组织（World Organisation for 上皮内接种操作困难，改用更加便捷的接种方式能 反复冻融3次后用于提取核酸，作为PCR模板。 为阴性 ［3］ ；同时利用 Reed-Muench 方法计算血清中
Animal Health，WOAH）列入必须通报疾病名录 ［3］ ， 1.4 PCR检测 ［9］
否产生较好或类似的免疫效果，尚需要试验研究，本 和抗体滴度 ，抗体稀释度≥1∶20 判定为阳性，<1∶
我国农业农村部将其规定为二类动物疫病。LSDV 研究山羊痘弱毒疫苗（AV41 株）经皮下和皮内接种 将处理好的鼻咽拭子以及全血样品，按照北 20则为阴性。
主要通过节肢动物媒介传播，直接接触也能引起该 京全式金病毒 DNA 提取试剂盒（EasyPure Viral
®
病的传播 ［4-5］ 。LSD起源于非洲赞比亚，在 20世纪以 牛体后的抗体产生规律进行评估，以便能为免疫程 DNA Kit，No.ER201）说明书进行病毒核酸提取。 1.6 统计分析
前主要在非洲地区呈地方性流行，2012 年先后传入 序的优化提供科学依据。 采用《WOAH 陆生动物诊断试验和疫苗手册》推荐 本研究所有数据存储于 Excel 表格中，随后导入
［1］
希腊和俄罗斯等欧洲国家 。2019 年 8 月首次在我 1 材料与方法 ［3，8］ R 软 件（version 4.1.2，R Development Core Team，
国新疆伊犁州地区发生 ［6］ ，之后向全国不同地区传 PCR 方法扩增 LSDV 核酸 。PCR针对的靶基因 2022）进行数据分析和可视化。检测方法之间的符
播。截至 2021 年 9 月，农业农村部通报了全国 15 个 1.1 实验动物及分组方案 是 LSDV074 基因中一段保守序列，扩增产物片段的 合率、敏感性、特异性、阳性和阴性预测率采用 Dohoo
省市的41起疫情，并有进一步扩散的风险。 25 头 12~18 月龄西门塔尔牛来自于未发生过 大小为 192 bp。引物序列如下：Forward primer 5′ 等 ［10］ 的介绍计算；利用皮尔逊相关性检验（Pearson’s
-TCC-GAG-CTC-TTT-CCT-GAT-TTT-TCT- correlation）对 NI与 log 10 转换的 S/P 值进行相关性分
TAC-TAT-3′，Reverse primer 5′-TAT-GGT-ACC- 析。由于存在较多阴性抗体 NI 值为 0 的干扰，去除
收稿日期：2022 ⁃ 04 ⁃ 22
基金项目：国家现代农业（肉牛/牦牛）产业技术体系专项（CARS-37）
TAA-ATT-ATA-TAC-GTA-AAT-AAC-3′。 引 NI 值为 0 的样品后进行简单线性回归拟合。epiR
王宇，E-mail：yu.wang1009@hotmail.com
通信作者：郭爱珍，E-mail：aizhen@mail.hzau.edu.cn 物由北京擎科生物科技有限公司（武汉分公司）合成。 包 ［11］ 用于计算以上各参数及其 95% 置信区间（confi⁃