Page 22 - 《华中农业大学学报》2020年第6期
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华 中 农 业 大 学 学 报 第 ３９ 卷
６
１
中香芹酚对猕猴桃软腐病菌的控制效果, 以期为探 ２×Ta q PCR Master Mix , １ μ L DNA , １ μ L １０
究猕猴桃采后软腐病的发病规律和绿色 防控提供 mmol / L 上游引物与１ μ L１０mmol / L 下游引物, １２
参考. μ L 超纯水. PCR 循环条件为 ９５℃ 预变性 ５ min ,
1 材料与方法 ９５℃３０s , ５８℃３０s , ７２℃３０s共３５ 个循环, ７２℃
修复延伸５min , ４℃ 保存. PCR 产物用１％ 琼脂糖
1.1 材料与试剂 进行凝胶电泳, 电压 １２０V , 时间 ２０ min , 在凝胶成
发病猕猴桃果实分别采集于湖北省襄阳市谷城 像分析仪中进行拍照检测. PCR 产物经琼脂糖凝
县万丰园猕猴桃基地、 陕西周至县猕猴桃基地及华 胶电泳检测后, 由天一辉远生物科技( 武汉) 有限公
中农业大学周边超市.用于模拟销售贮藏实验的猕 司进 行 测 序, 测 序 结 果 在 NCBI 数 据 库 中 进 行
猴桃采自周至县猕猴桃基地, 品种为“ 徐香”.培养
BLAST 比对分析, 确定菌株的分类地位.
基为马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 ( PDA ) 培 养 基; ２×Ta q 1.5 香芹酚对猕猴桃软腐病病原菌的抑制作用
PCR MasterMix购自天一辉远生物科技有限公司. 采用生长速率法 [ １２ ] 测定香芹酚对猕猴桃软腐
香芹酚购自上海麦克林生化科技有限公司; 所用其
病原真菌的抑制效果.将病原菌孢子接种至 PDA
他试剂均 为 分 析 纯, 购 自 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限
培养基 上 于 ２６ ℃ 培 养 ３d 后, 于 菌 落 边 缘 处 用
公司.
７mm的打孔器取菌饼, 将菌饼反贴于 PDA 培养基
1.2 病原菌分离与纯化
上; 然后, 在无菌滤纸片上滴加 ０ 、 ０．２９ 、 ０．５８ 、 ０．８７ 、
采用组织分离法 [ １０ ] 对致病真菌进行分离, 具体
１．１６ 、 １．４５ 、 １．７４ μ g 香芹酚并反贴于培养皿内盖中
步骤如下: 用水清洗猕猴桃病果表面, 用灭菌解剖刀
央, 快速用封口膜将培养皿密封, 使香芹酚的终质量
切取病健交接处组织, 将组织小块在 ７５％ 乙醇中浸
/
浓度分别为 ０ 、 ２．９ 、 ５．８ 、 ８．７ 、 １１．６ 、 １４．５ 、 １７．４ μ g L .
泡 ５s , 无菌水清洗 ３ 次, 最后接在 PDA 培养基上,
以不含香芹酚作为对照; 每个浓度设置 ３ 个重复, 置
于 ２６℃ 恒温条件下倒置培养, 当菌落直径为 １cm
于 ２６ ℃ 条 件 下 培 养 ７２h 后 测 定 病 原 菌 的 菌 落
时, 挑取菌落边缘菌丝转接到新的 PDA 培养基内
直径.
于 ２６℃ 恒温条件下倒置培养, 经 ３~５ 次划线分离,
1.6 模拟销售条件下香芹酚对猕猴桃软腐病的控
直至获得纯病原菌菌落, ４℃ 冰箱保存.
制效果
1.3 致病性测定
挑选大小、 色泽及成熟度一致且无机械损伤的
根据柯赫氏法则进行致病性测定: 挑选健康、 无
健康徐香猕猴桃果实, 将 ５０ μ L５８m g L 香芹酚溶
/
损伤的“ 徐香” 猕猴桃果实, 用 ７５％ 乙醇溶液表面消
毒, 取菌落边缘的菌饼( 直径为 ５mm ), 采用针刺法 液均匀喷施在包装纸表面, 晾干后包裹猕猴桃果实,
然后将猕猴桃置于聚乙烯保鲜袋中, 并于模拟常温
将菌饼接种于伤口处.以接种无菌的 PDA 培养基
货架环境( 温度为 ２５℃ 、 相对湿度为 ９０％ ) 条件下
作为对照, 于 ２６℃ 恒温培养, 记录发病情况并釆用
十字交叉法测量病斑直径.发病后于病斑处再次分 放置.以上每个处理设置 ３ 个重复, 每个重复 ３０ 个
离培养病原菌, 并与原接种菌株进行对比, 形态学鉴 果实.放置期间每隔 ２d统计猕猴桃果实的软腐病
发病率, 并取样用于品质指标测定.果实硬度使用
定一致则确定为该病原菌.
1.4 病原菌鉴定 GYＧ４ 型水果硬度计测定, 可 溶 性 固 形 物( SSC ) 含
１ ) 形态学鉴定.根据各致病菌株在 PDA 上的 量使用手持 测 糖 仪 测 定, 可 滴 定 酸 ( TA ) 含 量 参
菌落特征、 光学显微镜下菌丝形态、 分生孢子及分生 照文献[ １３ ] 的 酸 碱 滴 定 法 测 定. V C 含 量 采 用 磷
孢子 梗 的 形 状、 色 泽、 菌 丝 隔 膜 等 性 状 进 行 初 步 钼酸法测定, 总 酚 ( TP ) 和 总 类 黄 酮 ( TF ) 分 别 参
鉴定. 考朱仙慕等 [ １４ ] 和陆蓓等 [ １５ ] 的 紫 外 分 光 光 度 法 进
２ ) 分 子 生 物 学 鉴 定. 参 照 Edwards 等 [ １１ ] 的 行测定.
CTAB 法提取菌株 DNA .真菌rDNAＧITS 区的通
2 结果与分析
用 引 物 ITS１ ( ５′ＧTCCGTAGGTGAACCTGCGGＧ
３′ )和 ITS２ ( ５′ＧTCCTCCGCTTATTGATATGCＧ 2.1 猕猴桃果实软腐病病原菌的显微形态特征
３′ ) 作为 PCR 扩 增 引 物.引 物 扩 增 体 系 为: １５ μ L 本研究从 ５０ 个不同来源的猕猴桃软腐病发病
