Page 34 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第1期
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28                                 华 中 农 业 大 学 学 报                                    第 42 卷

               期正常果实与脱落果实。以叶片为材料，使用 20%                         等基本理化性质，用在线分析工具 SignalP 4.1 Serv‐
               PEG6000 和 20 mmol/L NaCl 溶液分别模拟干旱和               er （http：//www. cbs.dtu.dk/services /SignalP-4.1/）
               盐胁迫，采集处理 0、2、4、6、8 h 的材料，采集后迅速                   分析 PavEXPA2 基因所编码的氨基酸序列的信号
               用液氮速冻，后于-80 ℃中保存备用。以上材料均                         肽，利用 Cell PLoc2.0（http：//www.csbio. sjtu.edu.
               设置3个生物学重复。                                       cn/bioinf /Cell-PLoc-2/）进行亚细胞定位预测。
               1.2 甜樱桃PavEXPA2基因的克隆                             1.4 qRT-PCR分析
                   用植物多糖多酚 RNA 提取试剂盒（赛诺生物科                          根据克隆获得的 PavEXPA2 基因序列，用 prim‐
               技有限公司，中国张家口）提取甜樱桃果柄总 RNA， er 5 设计特异性引物，引物序列 PavEXPA2-Y-F：
               用 MutiscanGO（Thermo，美国）和琼脂糖凝胶电泳对                 CTTCTTTCTCATCTCCTCTGCC， PavEXPA2-

               RNA 质 量 进 行 检 测 ，并 用 PrimeScriptTMRT  re‐        Y-R：CCAAGGAACCATACC CACAA，在上海生
               agent Kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa，日本） 工生物工程有限公司合成。以甜樱桃不同组织的
               对甜樱桃果柄总 RNA 进行 cDNA 第 1 链合成，使用                   cDNA 为模板，以 PavRSP3 和 PavEF1-α2 为内参基
               内 参 基 因 检 测 cDNA 的 完 整 性 并 于 -20  ℃ 保 存          因 ［9］ ，引 物 序 列 为 ：PavEF1- α2-F：ATCCAGAG‐
               备用。                                              TAGCA  GAACCAATCAC，PavEF1- α2-R：GT‐
                   在甜樱桃基因组数据库中搜索该基因的 CDS序                       TAGGCATCCAGTCCCAGAAT，在 CFX  96TM
               列，利用 Primer Premier 5 软件设计特异引物 PavEX‐            Real-Time  System（Bio-rad，美 国）实 时 荧 光 定 量
               PA22-F：CACATGCTGACCTGTCCTCC、PavEX⁃               PCR 仪上进行。反应采用三步法，程序为：94 ℃预扩
               PA2-R：  CC  GCCTAACCTCCTAAC  TCTAAT， 增 10 min；94 ℃ 变性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸
               提交至上海生工生物工程有限公司合成。                               30 s，40 个循环。采用 2      -ΔΔCt  法计算基因的相对表
                   以 cDNA 为模板，利用上述合成引物进行 PCR                    达量。
               扩增。PCR 反应体系为：ddH 2 O 3 μL，高保真 mix                2 结果与分析
              （TaKaRa，日本）5 μL，cDNA 1 μL，上游和下游引物
               各 0.5 μL，共 10 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性               2.1 甜樱桃PavEXPA2克隆与生物信息学分析
               5 min；94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 10 s，           以甜樱桃果柄 cDNA 为模板，通过 PCR 扩增获
               35 次循环；最后 72 ℃延伸 7 min。用 1% 琼脂糖凝胶                得与预期目的基因片段大小一致的条带，将目的条
               电泳检测扩增 PCR 产物纯度，用琼脂糖凝胶回收试                        带回收并测序，结果显示序列长度为 1 035 bp，开
               剂 盒 对 目 的 条 带 进 行 回 收 ，将 回 收 产 物 连 接 到           放 阅 读 框（ORF）为 852  bp，编 码 283 个 氨 基
               pEASY-Blunt  Cloning  Kit（全 式 金 ，北 京）并 转 化       酸（图 1）。
               DH5α大肠杆菌，37 ℃活化 1 h后吸取 100~200 μL活                   采用 ProtParam 分析可知，PavEXPA2 蛋白质分
               化产物涂布于 Kan 抗性的 LB 平板上，于 37 ℃过夜培                  子式为 C 1366  H 2125  N 3750 408 S 15 ，等电点为 8.90，分子质
               养，待长出菌落后挑取单菌落进行菌落 PCR 验证，对                       量约为 30.81 ku。PavEXPA2 蛋白总的负电荷残基
               检验出的阳性克隆进行培养，将阳性菌液送至上海                           数（Asp+Glu）为 21 个，正电荷残基数（Arg+Lys）为
               生工生物工程有限公司测序。                                    29 个，由此推测该蛋白带正电荷。该蛋白含量最丰
               1.3 PavEXPA2基因的生物信息学分析                           富的氨基酸分别为丙氨酸 Ala（9.9%）、甘氨酸 Gly
                   用 NCBI 在 线 分 析 工 具 ORF  Finder（http：// （8.8%）、丝氨酸 Ser（8.8%）、亮氨酸 Leu（8.8%）和赖
               www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.Html）寻找 DNA 的    氨酸 Lys（6.4%）。蛋白的不稳定系数为 41.88，这表
               开放阅读框，通过 DNAMAN 软件进行蛋白质翻译、 明该蛋白属于不稳定蛋白质。氨基酸残基疏水性总
               NCBI  Blastp 进 行 蛋 白 质 同 源 性 比 对 ，利 用            和（GRAVY）是-0.139，所以该蛋白亲水性较强。

               MEGA5.1 构建进化树。利用在线软件 TMHMM                           采用 SignalP 4.1 Server 在线预测得知 PavEX‐
               Server  v. 2.0（http：//www.  cbs. dtu. dk /services/  PA2 蛋白存在 1 个信号肽，且信号肽裂解位点位于
               TMHMM/）对 PavEXPA2蛋白的跨膜结构域进行预                     41~42（图 2）。用在线软件 TMHMM Server v.2.0预
               测 ，用 ProtParam（https：//web. expasy. org/  prot‐  测跨膜结构域，结果显示，PavEXPA2 为跨膜蛋白，
               param/）分析 PavEXPA2 蛋白的分子质量和等电点                   含有 2 个跨膜螺旋结构（图 3）。利用 Cell PLoc 2.0
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