Page 43 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第4期
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第 4 期          单亚静 等：耐高温纤维素降解菌对高温处理的动物尸体堆肥过程中氮素损失的影响                                       37

                                ［9］
               dasius BGSC 95A1） 。该菌株可在 80 ℃下生存且                样品进行适当的前处理。先加入脱腐缓冲液（100
               产酶的最适温度为 65 ℃，其纤维素酶活性高达 94.00                    mmol/L Tris，100 mmol/L Na 4 P 2 O 7 ，100 mmol/L
               U/mL。根据菌株生长的最适条件，将 P. thermoglu⁃                 Na 2 EDTA，1.0% PVP，100 mmol/L NaCl，0.05%

               cosidasius 培养约 1 周，至分光光度计在 600 nm 波长             Triton X-100，pH=10.0），涡旋混匀并 12 000 r/min
               下测定菌液吸光度值为 1.2 左右时，作为最终的高温                       离心，后续加入氯化钙溶液（0.5 mol/L）和草酸钠
               纤维素菌剂备用。                                        （0.05 mol/L）继 续 前 处 理 。 用 改 进 的 蛋 白 酶 K-
                   2）堆肥处理。将鸡和鸭的尸体（华中农业大学                        CTAB 法粗提取堆肥样品中的总 DNA，然后检测总
               鸡场提供）在焚烧炉内进行高温处理后再开展堆肥                           DNA 的浓度和质量。基因的引物设计如表 1 所示，
               试验。堆肥在规格为 138 L 的泡沫箱中进行，堆肥方                      引物合成在武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行。
               式为好氧静态通风堆，均采用60 L/（m·min）的通风                     PCR 反应条件为 95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，
                                                 3
               处理。将高温处理后的动物尸体分为 2组，分别是不                         58 ℃退火 15 s（16S rDNA 为 53 ℃退火 45 s），72 ℃延
               添加菌剂的对照组和菌剂组（根据每个堆体的总质                           伸 20 s（16S rDNA 为 72 ℃退火 90 s），35 个循环；再
               量添加 1% 高温纤维素菌剂），每组 3 个重复。动物                      72 ℃延伸 10 min。纯化回收得到的 PCR 产物按初始
               尸体在高温焚烧炉进行高温处理（160 ℃处理 12 h） 浓度的 10                      -1 至 10 -10 共 11 个浓度并根据不同浓度所
               后，将动物尸体与秸秆进行混合，利用秸秆和竹粉调                          对应的 Ct 值绘制标准曲线，然后计算样品中相应基
               节碳氮比为 30∶1，初始含水率为 60% 左右，堆肥时间                    因的拷贝数。荧光定量 PCR 所需的引物参考文献
               为 28 d。采用五点采样法采集尸体与秸秆的混合物 ［12］来设计（表1），反应条件同PCR条件。最后根据
               作为分析样品，混匀后将样品分为 2 份，一份保存于                        定量数据中标准品的数值绘制标准曲线，并计算实
               4 ℃冰箱，用于测定堆肥过程中的理化参数，包括温                         际样品中的基因拷贝数。每个基因均做 5 个技术重
               度、pH、含水率、铵态氮、硝态氮、亚硝态氮、总碳和总                       复。将基因的原始拷贝数进行对数转换，利用 Cano‐
               氮。另一份保存于-80 ℃冰箱，用于测定样本中氮                         co 4.5软件和 SPSS 21.0软件对各个理化参数与氨单
               素转化功能基因的拷贝数。                                     加氧酶基因（ammonia monooxygenase，amoA）、硝酸
               1.2  试验方法                                        盐 还 原 酶 基 因（nitrate reductase subunit alpha，
                   1）温度、pH 和含水率的测定。记录环境温度并                      narG）、亚硝酸盐还原酶基因（copper-containing ni‐
               用长柄电子温度计按照时间间隔，测定堆体中心不                           trite reductase，nirS 和 nirK）和氧化亚氮还原酶基因
               同区域的温度，取其平均值。堆肥样品的 pH 用精密                       （nitrous oxide reductase，nosZ）的拷贝数分别进行相
               pH 计（PHS-3C，上海宇隆仪器有限公司）测定。在                      关性分析，确定理化参数与基因数量之间的线性相
               烘箱中 105 ℃烘干样品至恒质量，通过前后质量的变                       关性。
               化计算含水率。                                                       表1   试验所用引物序列
                   2）铵态氮、硝态氮和亚硝态氮含量的测定。用 2                           Table 1  Sequence of different primers used
               mol/L氯化钾对堆肥样品进行前处理，过滤后用靛酚                                       in this experiment
               蓝分光光度法检测铵态氮含量。用标准曲线法和紫                                 引物 Primer        序列（5′-3′）Sequence（5′-3′）
               外分光光度计（721，上海第三分析仪器厂）测定吸光                             amoA-F         GGGGTTTCTACTGGTGGT
               度，计算硝态氮浓度。用盐酸萘乙二胺分光光度法                                amoA-R         CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
               测定亚硝态氮浓度。                                             narG-F         TAYGTGGGCAGGARAACTG
                                                                     narG-R         CGTAGAAGAAGCTGGTGCTGTT
                   3）总氮和总碳含量的测定。将堆肥样品在烘箱
                                                                     nirS-F         GTSAACGTSAAGGARACSGG
               中 80 ℃烘干 24 h 后，过筛孔径为 0.15 mm 的标准筛，
                                                                     nirS-R         GASTTCGGRTGSGTCTTGA
               用分析天平称取约 4.0~4.5 mg的样品。采用锡盒将
                                                                     nirK-F         TCATGGTGCTGCCGCGYGANGG
               样 品 包 裹 成 圆 球 状 ，然 后 用 同 位 素 质 谱 分 析 仪
                                                                     nirK-R         GAACTTGCCGGTKGCCCAGAC
              （Isoprime100，德国元素分析系统公司）进行总碳和                          nosZ-F         GGGCTBGGGCCRTTGCA
               总氮含量的测定。                                              nosZ-R         GAAGCGRTCCTTSGARAACTTG
                   4）DNA 的提取与荧光定量 PCR 检测。为了减                         16S rDNA-F     AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
               少外源 DNA 和酸性物质所造成的污染，首先对堆肥                             16S rDNA -R    TACCTTGTTACGACT
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