Page 42 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2022年第4期

第41卷 第4期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vol.41 No.4
2022年 7月 Journal of Huazhong Agricultural University July 2022，36~42

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单亚静，吴坤坦，高健玮，等 . 耐高温纤维素降解菌对高温处理的动物尸体堆肥过程中氮素损失的影响［J］. 华中农业大学学报，2022，41（4）： dasius BGSC 95A1） 。该菌株可在 80 ℃下生存且 样品进行适当的前处理。先加入脱腐缓冲液（100
36‐42.DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2022.04.005 产酶的最适温度为 65 ℃，其纤维素酶活性高达 94.00 mmol/L Tris，100 mmol/L Na 4 P 2 O 7 ，100 mmol/L
U/mL。根据菌株生长的最适条件，将 P. thermoglu⁃ Na 2 EDTA，1.0% PVP，100 mmol/L NaCl，0.05%
耐高温纤维素降解菌对高温处理的动物尸体堆肥 cosidasius 培养约 1 周，至分光光度计在 600 nm 波长 Triton X-100，pH=10.0），涡旋混匀并 12 000 r/min

下测定菌液吸光度值为 1.2 左右时，作为最终的高温 离心，后续加入氯化钙溶液（0.5 mol/L）和草酸钠
过程中氮素损失的影响 纤维素菌剂备用。 （0.05 mol/L）继 续 前 处 理 。 用 改 进 的 蛋 白 酶 K-
2）堆肥处理。将鸡和鸭的尸体（华中农业大学 CTAB 法粗提取堆肥样品中的总 DNA，然后检测总
单亚静，吴坤坦，高健玮，杨旭晨，郑嵘 鸡场提供）在焚烧炉内进行高温处理后再开展堆肥 DNA 的浓度和质量。基因的引物设计如表 1 所示，

华中农业大学动物科学技术学院，武汉 430070 试验。堆肥在规格为 138 L 的泡沫箱中进行，堆肥方 引物合成在武汉奥科鼎盛生物科技有限公司进行。
式为好氧静态通风堆，均采用60 L/（m·min）的通风 PCR 反应条件为 95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，
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摘要 为探究纤维素降解菌在堆肥腐熟中的应用效果，试验将高温处理后的畜禽尸体与秸秆混匀后，分为 处理。将高温处理后的动物尸体分为 2组，分别是不 58 ℃退火 15 s（16S rDNA 为 53 ℃退火 45 s），72 ℃延
不添加菌剂的对照组和添加 1% 的耐高温纤维菌（Parageobacillus thermoglucosidasius）的菌剂组，采用好氧静态 添加菌剂的对照组和菌剂组（根据每个堆体的总质 伸 20 s（16S rDNA 为 72 ℃退火 90 s），35 个循环；再
通风的方式堆肥 28 d，测定堆肥过程中的理化参数（温度、pH、含水率、铵态氮、硝态氮、亚硝态氮、总碳和总氮）
量添加 1% 高温纤维素菌剂），每组 3 个重复。动物 72 ℃延伸 10 min。纯化回收得到的 PCR 产物按初始
和氮素转化功能基因拷贝数的变化等氮素损失相关的指标。结果显示，菌剂组的铵态氮含量和亚硝态氮含量均 -1 -10
尸体在高温焚烧炉进行高温处理（160 ℃处理 12 h） 浓度的 10 至 10 共 11 个浓度并根据不同浓度所
显著高于对照组，但最终总氮含量菌剂组低于对照组。堆肥前期对照组的 nirK 拷贝数显著高于菌剂组，且与
后，将动物尸体与秸秆进行混合，利用秸秆和竹粉调 对应的 Ct 值绘制标准曲线，然后计算样品中相应基
NH 4 含量显著正相关；菌剂组的 nirS拷贝数极显著高于对照组，且与 NO 3 含量极显著正相关。堆肥中期，对照
-
+
组的 narG拷贝数极显著高于菌剂组，且与 NH 4 含量相关性接近显著水平（P=0.064）；堆肥后期，对照组的 nosZ 节碳氮比为 30∶1，初始含水率为 60% 左右，堆肥时间 因的拷贝数。荧光定量 PCR 所需的引物参考文献
+
为 28 d。采用五点采样法采集尸体与秸秆的混合物 ［12］来设计（表1），反应条件同PCR条件。最后根据
拷贝数极显著高于菌剂组。以上结果表明，耐高温纤维素降解菌主要通过氨氧化作用和反硝化作用在堆肥的前
期来改变堆体的氮素循环，但也会促进反硝化作用导致氮素损失的增加。 作为分析样品，混匀后将样品分为 2 份，一份保存于 定量数据中标准品的数值绘制标准曲线，并计算实
关键词 畜禽尸体；高温处理；堆肥；氮素损失；纤维素降解菌 4 ℃冰箱，用于测定堆肥过程中的理化参数，包括温 际样品中的基因拷贝数。每个基因均做 5 个技术重
中图分类号 S141.4 文献标识码 A 文章编号 1000-2421（2022）04-0036-07 度、pH、含水率、铵态氮、硝态氮、亚硝态氮、总碳和总 复。将基因的原始拷贝数进行对数转换，利用 Cano‐
氮。另一份保存于-80 ℃冰箱，用于测定样本中氮 co 4.5软件和 SPSS 21.0软件对各个理化参数与氨单
高温处理可以减少动物尸体中存在的病原菌 ， 菌株，鉴定为热葡糖苷酶地芽孢杆菌（Parageobacil⁃ 素转化功能基因的拷贝数。 加氧酶基因（ammonia monooxygenase，amoA）、硝酸
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但将高温处理后的动物尸体直接施用于农田，将造 lus thermoglucosidasius BGSC 95A1） 。该菌降解 1.2 试验方法 盐 还 原 酶 基 因（nitrate reductase subunit alpha，
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成“二次发酵”，导致烧苗现象 ，因此需对高温处理 纤维素的能力很强，但其应用于堆肥中对堆肥效率 1）温度、pH 和含水率的测定。记录环境温度并 narG）、亚硝酸盐还原酶基因（copper-containing ni‐
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后的尸体进行发酵腐熟的堆肥处理。但堆肥过程中 的影响尚不清楚。检测堆肥中氮元素相关的物质 用长柄电子温度计按照时间间隔，测定堆体中心不 trite reductase，nirS 和 nirK）和氧化亚氮还原酶基因
的高温、高 pH 促使 NH 3 逸出、厌氧条件下反硝化作 （铵态氮、硝态氮、亚硝态氮和总氮）和氮素转化功能 同区域的温度，取其平均值。堆肥样品的 pH 用精密 （nitrous oxide reductase，nosZ）的拷贝数分别进行相
用引起的 N 2 O和 N 2 弥散以及水溶性含氮成分的渗滤 基因拷贝数 ［10-11］ 的变化能反映不同堆肥时期氮素转 pH 计（PHS-3C，上海宇隆仪器有限公司）测定。在 关性分析，确定理化参数与基因数量之间的线性相
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均造成了氮素损失 。在猪尸体堆肥中加入氨转化 化作用的变化。因此，本试验将热葡糖苷酶地芽孢 烘箱中 105 ℃烘干样品至恒质量，通过前后质量的变 关性。
细菌、亚硝酸盐转化菌和固氮菌可以加速氮的积累， 杆菌加入到高温处理后的动物尸体中与秸秆混合进 化计算含水率。 表1 试验所用引物序列
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减少氮素的损失 。而具有纤维素降解性和固氮性 行堆肥，检测氮元素相关物质和氮素转化功能基因 2）铵态氮、硝态氮和亚硝态氮含量的测定。用 2 Table 1 Sequence of different primers used
的菌剂可以促进木质纤维素的降解，提高堆肥效 拷贝数的变化，探究菌剂影响动物尸体堆肥氮素损 mol/L氯化钾对堆肥样品进行前处理，过滤后用靛酚 in this experiment
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果 。如孙元烽等 筛选到的细菌能有效强化菌剂 失的途径，以期为未来在堆肥中添加纤维素降解菌 蓝分光光度法检测铵态氮含量。用标准曲线法和紫
的纤维素降解能力，并一定程度上提高堆肥中的总 等微生物来促进堆肥过程和减少氮素损失提供数据 外分光光度计（721，上海第三分析仪器厂）测定吸光
养分；武肖莎等 ［7］ 筛选得到枯草芽孢杆菌应用于牛 参考。 度，计算硝态氮浓度。用盐酸萘乙二胺分光光度法
粪-秸秆的堆肥中，发现菌剂组能有效提高堆肥效 测定亚硝态氮浓度。
1 材料与方法
率。目前关于纤维素分解菌的研究大多是应用在畜 3）总氮和总碳含量的测定。将堆肥样品在烘箱
禽粪便、秸秆和生活有机废弃物上，而用于畜禽尸体 1.1 试验设计 中 80 ℃烘干 24 h 后，过筛孔径为 0.15 mm 的标准筛，
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的研究相对较少 。课题组前期从猪尸体和秸秆堆 1）菌株的来源。试验菌株为笔者所在实验室前 用分析天平称取约 4.0~4.5 mg的样品。采用锡盒将
肥样品中筛选到 1 株能在 80 ℃下生存的纤维素降解 期获得的热葡糖苷酶地芽孢杆菌（P. thermoglucosi⁃ 样 品 包 裹 成 圆 球 状 ，然 后 用 同 位 素 质 谱 分 析 仪
（Isoprime100，德国元素分析系统公司）进行总碳和
收稿日期：2022‐01‐06 总氮含量的测定。
基金项目：湖北省技术创新专项重大项目（2017ABA137）；湖北省重点研发计划项目（2021BBA082）
4）DNA 的提取与荧光定量 PCR 检测。为了减
单亚静，E-mail：289795749@qq.com
通信作者：郑嵘，E-mail：zhengrong@mail.hzau.edu.cn 少外源 DNA 和酸性物质所造成的污染，首先对堆肥