Page 15 - 《华中农业大学学报》2020年第6期

第 ６ 期 张鑫泽 等:萝卜蚜端粒逆转录酶 TERT 基因的鉴定与表达分析 ９

２ ) 培养条件.温度( ２５±１ ) ℃ , 光周期 １４L∶ 应条件为 ９５℃ 预变性 ４min , ９５℃ 变性 ２０s , ５５~
１０D , 湿度 ７０％±５％ . ６０℃ 退火 ２０s , ７２ ℃ 延伸 ２ min , ３５ 个循环, 最后
３ ) 主要试剂及仪器.智能人工气候箱, 武汉瑞 ７２℃ 延伸 ７ min . PCR 产物用溶解在 ０．７５×TAE
华仪 器 设 备 有 限 责 任 公 司; RNAiso Plus 试 剂, buffer的 １％ 琼脂糖凝胶电泳进 行检测, 检测正确

TaKaRa公司; cDNA 反转录试剂盒, TaKaRa公司; 的 PCR 产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒 进 行 回 收.
®
PCR , PrimeSTAR HSDNAPol y merase , TaKaRa 回收产物与 p MD１９ＧT 载体连接, 连接体系转化 T１
公司; 胶回收试剂盒, DNA GelExtractionKit , AxＧ 感受态细胞, 挑取正确阳性克隆送至武汉擎科生物

y Gen 公 司; RTＧPCR 试 剂 盒, TransStart Ti p 技术有限公司进行测序并拼接.
q
Greenq PCRSu p erMix , Trans 公司; ２×Ta q MasＧ 1.6 端粒酶 TERT 基因生物信息学分析
terMix , Sim p leBio . 将克隆 得 到 的 序 列 进 行 生 物 信 息 学 分 析, 与
1.2 样品采集 NCBI库中的基因序列进行 Blast比对, 确定端粒酶
收集尚未产仔的无翅萝卜蚜成虫若干头置于铺 TERT 基因的 CDS 序列, 根据获得的序列 信息利
有湿润滤纸的培养皿中, 培养皿中放置新鲜白菜, 每 用蛋白预测工具 PSIPRED ( htt p :// bioinf．cs．ucl．ac．
２４h 更换 １ 次白菜, 保持滤纸的干净和湿润. ４８h uk / si p red /) 翻译成氨基酸序列, 并对 其二级结构
p
后可得到 １ 龄萝卜蚜若虫.若蚜共有 ４ 个龄期, 每 进行预测.利 用 BioEdit 软 件 将 萝 卜 蚜 TERT 基
蜕１ 次皮即为 １ 个龄期.挑取 １~４ 龄萝卜蚜若虫 因编码的氨基酸序列与其他物种进行同源性比较,
各２５~３０ 头, 萝卜蚜成蚜２０~２５ 头置于干净的１．５ 利用 MEGA X 软件构建萝卜蚜端粒酶与其他昆虫
mL 无酶离心管中, 放于 －８０℃ 冰箱中保存, 待提取 比对的系统发育进化树.
RNA .另取 ５０ 头 ４ 龄萝卜蚜若虫于体式显微镜下 1.7 实时荧光定量 PCR 分析 TERT 表达量
进行解剖, 将解剖得到的头部、 胸部、 腹部分别置于 按照本文“ １．２ ” 样品采集方法, 每个样品设 ３ 次
１．５mL 无酶离心管中, 放于 －８０℃ 冰箱中保存, 待 生物 学 重 复 和 ３ 次 技 术 重 复. 以 eIF ( 登 录 号:

提取 RNA . MG９９３３２８ ) 为内参基因, RTＧPCR 引物设计( 表 １ )
q
1.3 萝卜蚜总 RNA 提取( Trizol 法) 根据线性回归模型进行分析.将 cDNA 梯度稀释
将上述样品按照 RNA 提取的标准方法 [ １０ ] 分别 ( １ / ５ 、 １ / ２５ 、 １ / １２５ 、 １ / ６２５ 、 １ / ３１２５ ) 后进行标准曲线
提取萝卜蚜不同龄期及其不同组织的总 RNA , 并进 绘制, 使用扩 增效果最好的引物作为本研究 q RTＧ

行 RNA 质量检测, 检测合格后存于 －８０℃ 冰箱, 保 PCR 引物.引物设计见表 １ .
存待用. 将cDNA 产物稀释 ２０ 倍后作为 q RTＧPCR 模
1.4 cDNA 合成 板, 反 应 按 照 TransStartTi p Greenq PCR Su p erＧ

利用cDNA 反转录试剂盒对总 RNA 样品进行 Mix ( Trans ) 说 明 书 进 行. RTＧPCR 反 应 体 系 为
q
DNaseⅠ 处 理, 完 成 从 基 因 组 DNA 去 除 到 cDNA ５ μ L２×TransStartTi p Greenq PCR Su p erMix ,
合成的全过程. ０．２ μ L 正向引物( １０mmol / L ), ０．２ μ L 反向引物( １０
1.5 端粒酶 TERT 基因 CDS 序列克隆 mmol / L ), ２ μ LcNDA 模板和 ２．６ μ LddH ２O . RTＧ
q
利用 Blast检索数据库, 搜索与萝卜 蚜相近物 PCR 反应条件为９４℃ ３０s , ９４℃ ５s , ６０℃ ３０s , ４０
种的同一靶标基因蛋白或 cDNA 编码的氨基酸序 个循 环.数 据 采 用 ２ －ΔΔCt 法 [ １１ ] 进 行 计 算, 以 分 析
列.用本地获得的二代测序萝卜蚜转录组信息进行 TERT 基因在不同组织、 不同龄期的相对表达量.
比对查询, 确定所选基因的序列, 进行扩增.根据靶 1.8 数据统计分析
标基因 的 片 段 设 计 ３ 对 引 物 ( 表 １ ), 分 ３ 段 扩 增 利用 Sna p Gene 软件对序列的测序峰图进行人
TERT 基 因 的 CDS 区 域.以 萝 卜 蚜 cDNA 为 模 工核对, 利用 Blast ( NCBI ) 工具对 DNA 序列进行同
板, 根据 ２×Ta q MasterMix ( Sim p leBio )说明书 源性 分 析. 数 据 表 示 为 平 均 值 ±SE , 采 用 MiＧ
扩增靶标基因.反应体系为 ２２ μ LddH ２O , ２５ μ L crosoftExcel２０１０ 进行整理, 利用 SPSS２０ 软件进
２×Ta q MasterMix , １ μ LcDNA 模板, １ μ L 正向引 行单因素方差分析和 Duncan ’ s多重比较的差异显
物( １０mmol / L ), １ μ L 反向引物( １０mmol / L ).反 著性分析.