Page 47 - 《华农农业大学学报》2020年第2期
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第 ２ 期                  陈一铭 等:白斑综合征病毒感染对克氏原螯虾肠道菌群的影响                                      ４ １

               WSSV 病毒.对照组注射等量的 PBS 溶液.感染                      2 结果与分析
               后的第 ５ 天取感染组和对照组各 ５ 只虾, 经体表消
               毒后解剖取后肠用于后续分析.                                  2.1  WSSV 感染后病毒载量检测
               1.3  WSSV 的定量检测                                      试验用 克 氏 原 螯 虾 感 染 前 无 明 显 临 床 病 症.
                   以靶向于 WSSV 聚合酶的特异性引物 WDP０６ /                 WSSV 感染组于第 ３ 天开始表现活力降低、 副肢无
                 [ １１ ]
               ０７   为定量引物, 检测各组样品中 WSSVco p ies情况.             力、 对外界刺激反应弱等典型病症, 并于第 ５ 天开始
               引物序列为５′ＧTCAGCTTCAAGAATCCCAATAGＧ３′ /
                                                               出现死亡, 对照组试验期间无明显变化.定量 PCR
               ５′ＧACAACTAGCAAGCACTGGTATＧ３′ .每个 PCR 反
                                                               结果( 图 １ ) 显示感染组血淋巴的病毒载量均升高至
               应体 系 包 含 １０ μ LSYBRPremix , WDP０６ / ０７ 各 ０．５
                                                               １０co p ies / n g DNA 以 上, 对 照 组 病 毒 含 量 仅 为
                                                                 ８
               μ L , 组织 DNA１ μ L , 加无菌三蒸水使反应体系的总
                                                               １０ ~１０co p ies / n gDNA , 呈携带状态.进一步检测
                                                                 ２
                                                                      ４
                                                        ,
               体积至 ２０ μ L .扩增目的片段大小为 ３３０b p PCR
                                                               感染组和对照组后肠带毒量, 结果显示 WSSV 感染
               反应程 序 为: ９５ ℃ 预 变 性 ５ min ; ９５ ℃ 变 性 ５s ,
                                                               组后肠的带毒量也显著升高( P＜０．０５ ). ５ 个感染
               ５８℃ 退火 ３０s , ７２℃ 延伸 ３０s , 共 ４０ 个循环.定量
                                                                                                     ８．９
                                                                                               ８．０
                                                               组后肠样品 WSSV 病毒载量在 １０ ~１０ co p ies /
               扩增在 Li g htC y cler４８０ 实时荧光 PCR 仪上进行.
                                                                                                            ４
               1.4  肠道 DNA 提取与 16S rDNA PCR 扩增                 n gDNA , 而对照组后肠 WSSV 载量均未超过 １０
                   使用 CTAB 方法提取克氏原螯虾后肠的总基因组 co p ies / n gDNA , 同血淋巴带毒水平近似.
               DNA , 通过１％琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度.用
               无菌水将 DNA 稀释至１n gμ L 用于后续肠道微生物
                                      /
               的 １６SrDNA 的 扩 增.使 用 １６Sv３Ｇv４ 引 物 ３４１FＧ
                   [ １２ ]
               ８０６R   扩 增, 引 物 序 列 为 ５′ＧCCTAYGGGRBGCASＧ
               CAGＧ３′ / ５′ＧGGACTACNNGGGTATCTAATＧ３′ PCR .
               PCR 反应程序为: ９４℃ 预变性５min ; ９４℃ 变性５s ,
               ５５℃ 退火 ３０s , ７２℃ 延伸 ３０s , ２７ 个循环.
               1.5  16S rDNA 高通量测序与数据分析
                   肠道细菌 １６SrDNA 扩增产物建库按照诺禾致                     ∗∗ 表示显著性水平 P＜０．０１ . ∗∗indicatesasi g nificantdifferＧ
                                                               encewithP＜０．０１．
               源公司流 程 和 方 法, PCR 产 物 经 过 纯 化 后 制 备 文
                                                                图 １  对照组和 WSSV 感染组血淋巴及后肠组织病毒载量
               库, 测序使用 IonS５ XL 测序平台, 利用单端测序
                                TM
                                                                     Fi g ．１ Viralloadinhemol y m p handhind g utin
               ( Sin g leＧEnd ) 的方法, 构建小片段文库进 行单端测
                                                                       control g rou pandWSSVinfectedg rou p
               序.通 过 对 reads 剪 切 过 滤, 平 均 每 样 品 测 得
                                                               2.2  肠道细菌群落多样性指数分析
               ６９２５６ 条reads , 经过质控平均得到６５６５３ 条有效数
                                                                    如图２所示, 感染组与对照组共同拥有的 OTU
               据.舍弃低质量序列, 对原始下机数据( rawdata )
                                                               ２９１ 个, 感 染 组 特 有 OTU １６１ 个, 对 照 组 特 有
               进行碱基过滤, 随后的数据进行质量控制, 得到质控
                                                               OTU７５ 个. Chao１ 、 ACE 、 Shannon和 Sim p son４个αＧ
               后可用 于 后 续 分 析 的 有 效 数 据 序 列 ( cleandata ).
               将一致性( identit y 大于 ９７％ 的测序序列归为 １ 个
                               )
               操作分类单元 ( o p erationaltaxonomicunit , OTU )
               进行聚类和物种分析.统计各个样品所含 OTU 的
               数量, 通 过 维 恩 图 ( Venndia g ram ) 统 计 对 照 组 和
               WSSV 感染组样品共有的和特有的 OTU .利用包
               括覆盖率( covera g e )、 丰富度指数( Chao１ / ACE ) 以
               及多样性指数( Sim p son / Shannon ) 在内的 αＧ 多样性
               指数分析 ２ 组内微生物群落的丰度和多样性.同时                                 图 ２  感染组和对照组 OTU 数量对比
               在门和属 ２ 个分类水平上统计每个样品的物种丰度                              Fi g ．２ Venndi g ramofOTUnumberbetween
               和物种分布, 并做群落结构分析.                                        control g rou pandWSSVinfectedg rou p
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