Page 11 - 《华中农业大学学报（自然科学版）》2023年第1期

第 1 期 王贵 等：基于 IRAP 标记的沙子空心李遗传多样性评价及指纹图谱构建 5

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表2 L 16 （ 4 ） 正交试验表 济成本等因素，确定 PCR 体系（10 μL）最优为体
Table 2 Table of L 16 （4） orthogonal 系 7：10 mol/L IRAP 引 物 1.3 μL，PCR Mix 5.0
3
-5
experiments μL μL、模板 DNA（30 ng/μL）1.0 μL。PCR 扩 增 程 序
模板DNA IRAP引物
编号 PCR Mix 为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，51~58 ℃退火
Template DNA IRAP primer
No.
（30 ng/μL） （10 mol/L） 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 40 次循环；72 ℃再延伸 10
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1 0.6 3.0 0.7 min；4 ℃保存。
2 0.6 4.0 1.3
3 0.6 5.0 1.6
4 0.6 6.0 1.0
5 1.0 3.0 1.0
6 1.0 4.0 1.6
7 1.0 5.0 1.3
8 1.0 6.0 0.7
9 1.4 3.0 1.3
10 1.4 4.0 0.7
11 1.4 5.0 1.0
12 1.4 6.0 1.6
13 1.8 3.0 1.6
14 1.8 4.0 1.0
15 1.8 5.0 0.7
16 1.8 6.0 1.3
的等位基因数、有效等位基因数、Nei’s 基因多样性
指数及 Shannon 指数；利用 NTSYS 2.10e 软件 ［16］ 计
算遗传相似性系数后，通过 MEGA11 采用邻接法
M：DL2000 DNA marker；数字 1~16 代表 1~16 个 PCR 体系（表
（neighbor-joining）进行聚类，利用 Evolview（http：//
2） 1-16 represent 1-16 PCR systems（ see Table 2）.
evolgenius.info）美化聚类图。根据使用最少引物鉴 图1 10 μL IRAP-PCR体系优化结果
定尽量多供试种质的原则，确定核心引物，直接以统 Fig.1 Optimization results of 10 μL IRAP-PCR system
计获得的 0/1数据作为指纹代码，通过条形码和二维 2.2 IRAP引物筛选
码生成器（http：//qr-batch.com/）构建供试种质分子 对设计的 65 条 IRAP 引物进行筛选，最终筛选
身份证。 出 18条多态性良好、条带清晰且可重复性强的 IRAP
2 结果与分析 引物，且确定最佳退火温度为 51~58 ℃（表 3），部分
引物筛选结果见图2。
2.1 PCR反应体系优化 2.3 IRAP引物多态性分析
PCR 体系优化试验见图 1，泳道 1~16 分别对应 通过筛选出的 18 条 IRAP 引物对 92 份沙子空心
正交试验表（表 2）中体系 1~16，PCR 循环次数依次 李进行 PCR 分析，结果（表 4）显示，18 条 IRAP 引物
为 30、35、40。PCR 结果显示，循环 40 次为最优。根 共扩增出 189 个位点，其中多态性位点 180 个，平均
据 40次循环中电泳条带的数量、明暗及清晰度，16个 多态性位点比率为 95.24%。18 条引物的有效扩增
PCR 体系从优到差的排序为：7-12-11-16-3-4-8-2- 位点数 4~17，平均每个引物扩增 10.5 个位点，其中
6-14-15-10-5-9-1-13。通过对上述处理的各个因子 引物 Ty3-2扩增出的位点数目最多，共 17个，而 Ty3-
比较可知，IRAP 引物和 Mix 含量是影响条带多少及 14扩增位点数则最少，仅4个；另外，种质N39扩增出
明暗程度的主要因素。体系 1、5、9、13 中 Mix 含量 的位点数最多，为 118 个，种质 N10 扩增出的位点数
（3.0 μL）最少，条带均较少且不明亮；而体系 2、6、10、 则最少，共 47 个。18 条 IRAP 引物中多态性位点比
14 中 Mix 含量（4.0 μL）相同，体系 10 及 14 引物含量 例达到 100% 的共有 12条，表明这些引物具有较高的
（0.7 μL 及 1.0 μL）相 对 较 少 ，导 致 PCR 结 果 相 对 多态性，能够鉴别沙子空心李。引物 Ty3-2 及 Ty3-6
较差；同理，体系 8 及 15 也是如此。综上，考虑经 对 92 份沙子空心李种质 PCR 扩增结果见图 3。