Page 35 - 《华农农业大学学报》2020年第3期

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华 中 农 业 大 学 学 报 第 ３９ 卷
０．２mol / L 、 H７．８ 的磷酸缓冲溶液, 再加 １mL０．２ 采用欧阳光察法 [ １７ ] .每组处理设 ３ 次重复.
p
mmol / L 的 Ti ( Ⅳ ) ＧPAR 显色剂, ４５℃ 水浴保温 ２０ 1.5 总 RNA 的提取、 RT Ｇ PCR 和 qPCR 分析
. 采用 CTAB 酸 酚 法 [ １８ ] 提 取 棉 花 叶 片 中 的 总
min , 静置 １h 至 室 温, 测 ５０８nm 的 吸 光 值 D５０８
根据 ΔD５０８ 值计算 H ２O ２ 的含量.设 ３ 次重复. RNA .用 PrimerPremier５．０ 软件设计 GST ( GenＧ
1.4 POD 和 PAL 酶活性测定 Banknumber : AF１５９２２９．１ )、 PAL ( GenBanknumＧ
,
每处理各取叶片 １g 冰浴研磨, 分 ３ 次加入 １０ ber : JN０３２２９７．１ )、 持 家 基 因 Histon３ ( GenBank
mL 重蒸馏水, １００００r / min离心２０min , 取上清液 number : AF０２４７１６ ) 等基因的特异性 引 物、 扩 增 引
测定酶活性. POD 活性的测定用愈创木酚 法 [ １７ ] . 物均由上海Invitro g en 生物技术有限公司合成, 基
SOD 活性的测定用 NBT 法 [ １７ ] . PAL 酶活性测定 因特异性引物的相关信息见表 １ .
表 １ 基因特异性引物的相关信息
Table１ Informationonthe g enes p ecific p rimers
基因 Gene 引物 Primers ( ５′Ｇ３′ ) 长度 / b pLen g th
F : GTTGGACCGCTAGATGCAACTAGAA
GST ( AF１５９２２９．１ ) １８８
R : TTCTAGTTGCATCTAGCGGTCCAAC
F : ATGGAGTCCATCACTCAAAATGGTA
PAL ( JN０３２２９７．１ ) ３０７
R : TACCATTTTGAGTGATGGACTCCAT
F : GAAGCCTCATCGATACCGTC
Histon３ ( AF０２４７１６ ) ４５４
R : CTACCACTACCATCATGGC
分别取 １ μ g 总 RNA , 选用 Invitro g en 公司的 Pima９０ ( R ) 实生苗( 图 １A ), 洗净泥土, 伤根后再以
Su p erscri p tⅢ 试剂盒, 反转录合成 cDNA 第１ 条链. １．００×１０ 个 / mL 的黄萎病菌悬浮液直接浸泡棉苗
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GST 、 PAL 、 Histon３ 等基因第 ２ 链 cDNA 合成体 根部, 并重 新 根 植 于 同 样 的 土 壤 环 境 中, ５d 后 观
系( １０ μ L ) 包括: ０．５ μ LRT 产物、 １UTa q DNA 聚 察, 结果显示: 鄂棉 ２２ ( S ) 几乎全部萎蔫( 图 １BＧa );
Pima９０ ( R ) 受影响较小, 只有下部 ２ 叶萎蔫脱落, 上
合酶( TaKaRa 公 司)、 １ μ L１０×PCRbuffer 、 ０．２５
、
mmol / LdNTP 、 １．２５ mmol / L M g Cl ２ １０nmol / L 部叶片完好( 图 １BＧc ); 而海 / 陆嫁接棉苗( S / R ) 的萎
上游和下游引物各 ０．２５ μ L . PCR 反应条件: ９５℃
蔫程度介于二者之间( 图 １BＧb ).
３min ; ９４℃ ３０s , ５７℃ ３０s , ７２℃ １min ; ２４ 个循 2.2 黄萎病菌接种后棉苗叶片中 H 2 O 2 含量变化
环, ７２℃ 再延伸 １０min . PCR 扩增产物经 １％ 琼脂
采用伤根法接种黄萎病菌, 取棉苗主茎上部叶
糖凝胶电泳检测, 并采用全自动凝胶成像系统( S y nＧ
片, 测定不同时段叶片中 H ２O ２ 含量.结果显示: 鄂
g eneGeneGenius ) 拍照.
棉 ２２ ( S )、 Pima９０ ( R ) 和嫁接苗( S / R ) 在接种黄萎
以持 家 基 因 Histon３ 为 对 照, 利 用 ABI７５００
病菌后存在明显的差异( 图 ２ ).对照组中, 各时段
RealＧTimePCRS y stem 分析黄萎病接种后棉苗叶
片 GST 和PAL 的表达情况. RealＧtimePCR 反应 R 和 S 叶 片 中 H ２O ２ 含 量 差 异 不 显 著, 而 各 时 段
S / R 叶片中 H ２O ２ 含量均高于 R 和 S , 这可能是前
体系为 ２０ μ L , １ μ LRT 产物、 １０ μ LSYBRPremix
ExTa q TM 荧光定量酶、 目的基因上游和下游引物 期嫁接对棉苗造成的损伤所致.接种黄萎病菌后,
R 、 S 和 S / R 叶片中的 H ２O ２ 含量均大幅度升高, 其
各 ０．５ μ L 、 无菌双蒸水 ８ μ L . RealＧtimePCR 扩增
程序为: ９５℃ 预变性 ３０s ; ９５℃ 变性 ５s , ６０℃ 退火 中, S 叶片中 H ２O ２ 含量在接种后显著增加, 至 ２４h
g
和延伸 ３０s , ４０ 个循环.熔解曲线程序为: ９５ ℃ , 达到顶峰, 峰值为０．４３ μ mol / , 随后逐步下降; 而 R
－△△Ct 方法分析 叶片中 H ２O ２ 含量在接种后显著增加, 分别在 １６h
１５s ; ６０℃ , ３０s ; ９５℃ , １５s .利用 ２
不同时段基因相对表达水平.重复 ３ 次. 和 ４８h 出现大、 小 ２ 个峰, 峰值分别为 ０．５０ μ mol / g
和０．４０ μ mol / ; S / R 叶片中的 H ２O ２ 含量变化趋势
g
2 结果与分析
与 R 中类似, 也呈现大小 ２ 个峰, 但峰值分别出现
2.1 黄萎病菌液处理海/陆嫁接棉苗后表现 在 １６h 和 ９６h , 峰值分别为 ０．４３ μ mol / 和 ０．４１
g
当棉苗长至 ６ 叶 １ 心时, 选用苗龄相同、 生长态 μ mol / .在接种后 １９２h , 各处理与相应对照叶片
g
势一 致 的 鄂 棉 ２２ ( S )、 海 / 陆 嫁 接 棉 苗 ( S / R )、 中 H ２O ２ 含量接近.