Page 34 - 《华农农业大学学报》2020年第3期
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第 ３ 期     张明菊 等:黄萎病对海 / 陆嫁接棉苗叶片中 H ２O ２ 、 抗病相关酶活性和 GST 、 PAL 基因表达的影响                     ２ ９

               的产生是植物防卫反应的特征              [ ５ ] .活性氧( ROS ) 特  选择适当的砧木进行嫁接, 不仅能显著提高植物的
               别是超氧阴离子和过氧化氢( H ２O ２ 能杀死病原菌, 抗病性, 还会使作物的产量大幅度增加                                     [ １４Ｇ１５ ] .本研
                                               )
               或通过诱发感染部位的超敏反应限制病原菌的进一                          究选用黄萎病的海岛棉材料 Pima９０ ( R ) 为砧木, 以
               步侵染, 还能参与细胞壁组分的交联, 调控病程相关                       湖北省感病的陆地棉品种鄂棉 ２２ ( S ) 为接穗, 获得
               基因的表达, 并充当超敏反应过程中细胞凋亡和系                         海 / 陆嫁接棉苗( S / R ), 研究海岛棉 Pima９０ ( R )、 陆
               统获得抗性产生的信号分子              [ ６ ] .过氧化物酶( erＧ 地棉鄂棉 ２２ ( S ) 和海 / 陆嫁接棉苗( S / R ) 接种后的
                                                         p
               oxidases , PODs ; EC１．１１．１．７ ) 是含亚铁血红素的氧        抗性反应, 测定叶片中的 H ２O ２ 含量, POD 、 PAL 酶
               化还原酶类, 广泛地分布于植物、 动物、 微生物体内, 活性水平和 PAL 、 GST 基因表达模式的差异, 旨在
               其供体是 H ２O ２ 能催化不同底物氧化反应.过氧                      为棉花黄萎病抗性机制的深入探讨及利用嫁接对黄
                             ,
               化物酶以血红素为辅基, 参与细胞壁的合成、 植物应                       萎病进行有效防控提供依据.
               激反应、 生长调节等生理过程.在植物对病原菌的                         1 材料与方法
               防卫反应中通过激活诸如阿魏酸二聚化、 酚类氧化
               和木质化等生理代谢活动而发挥重要作用                    [ ７ ] .   1.1  嫁接苗准备
                   苯 丙 氨 酸 解 氨 酶 ( LＧ p hen y lalanineammonia       抗黄萎病的海岛棉品系 Pima９０ 种子由中国农
               l y ase , PAL ; EC４．３．１．５ ) 是苯丙烷代谢途径中的第         业科学院棉花研究所提供, 感病陆地棉品种鄂棉 ２２
               一个酶.苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸脱氨基生成                          ( S ) 由湖北省黄冈市农业科学院惠赠.选用 Pima９０
               反式肉桂酸, 反式肉桂酸是所有酚类衍生物合成的                         ( R ) 为砧木, 接穗为鄂棉 ２２ ( S ), 在棉苗 ２ 叶 １ 心时,
               共同前体.低温、 损伤和紫外照射处理后, 植物体内                       采用贴接法嫁接, 获得海 / 陆嫁接棉苗( S / R ).
               PAL 基因会增强表达, PAL 活性也会提高                 [ ８ ] .转     黄萎病菌大丽轮枝菌菌株 V ９９１ 由华中农业大学
               基因烟草品系中 PAL 基因沉默会抑制烟草花叶病                        作物遗传改良重点实验室棉花课题组提供.病菌活
               毒感染后的水杨酸的正常产生, 并丧失系统获得抗                         化后挑取少量菌丝, 移入 Cza p ek ’ s液体培养基中,
               性( SAR ) .转 基 因 烟 草 中 PAL 基 因 的 超 量 表 ２５℃ 、 １５０r / min振荡暗培养 ７~１０d .用 ４ 层纱布
                        [ ９ ]
               达, 会导 致 大 量 绿 原 酸 的 产 生 和 对 烟 草 蛙 眼 病 菌         过滤去除菌丝, 获得孢子悬浮液.显微镜下用血球
               ( Cercos p oranicotianae ) 感染敏感性下降   [ １０ ] .而谷  计数板统 计 孢 子 数 目, 将 孢 子 悬 浮 液 配 成 浓 度 为
                                                                       ７
               胱甘 肽 ＧSＧ 转 移 酶 ( lutathioneＧSＧtransferase , GST ; １．００×１０ 个 / mL 的孢子悬浮液, 备接种使用.
                                g
               EC２．５．１．１８ ) 是一种广泛存在于动、 植物和微生物体                 1.2  棉苗黄萎病菌接种处理
               内的多功能酶.植物 GST 的主要作用是催化还原                             在试管中直接用 １．００×１０ 个 / mL 的孢子悬浮
                                                                                           ７
               型谷胱甘肽的巯基与多种亲电和亲脂底物的结合, 液浸泡伤根后的棉苗根部, 观察不同棉苗处理后的
               降 低 细 胞 体 内 活 性 氧 ( reactiveox yg ens p ecies , 表现( 图 １ ).参照无底塑钵菌液浇根法               [ １５ ] 用刀片切
               ROS ) 水平, 在植物的初级代谢和次级代谢、 胁迫耐                    去定 植 棉 苗 的 塑 料 杯 底, 以 黄 萎 病 菌 １．００×１０        ７
               受和细胞信号转导中行使功能, 从而影响植物的代                         个 / mL 的孢子悬浮液对根部接种, 对棉苗叶片取样
               谢发育   [ １１ ] .病原微生物侵染可诱导小麦幼苗合成                  测定.接种试验于 ２０１５ 年 ３－５ 月在黄冈师范学院
               GST , 且 GST 活性增加与小麦的抗性相关               [ １１ ] .棉  生物与农业资源学院生化实验室进行, 重复 ３ 次.
               花枯萎病菌( Fusariumox y s p orum f．s p ．vasin f ecＧ  1.3  叶片中 H 2 O 2 的测定
              tum ) 侵染棉花根部和下胚轴, 可增强 GST 同源基                         参照刘俊等     [ １６ ] 的方法, 取上部棉花叶片( 主茎
               因的表达     [ １２ ] .用大丽轮枝菌毒素诱导棉花悬浮细                自下而上第 ４~５ 叶) １．５g 剪碎后加 ３ mL 冷丙酮
                                                                                       ,
               胞时, GST 基因表达增加, 抗病品种与感病品种相                      匀浆, ４℃ 、 １２０００r / min 离心１０min , 取１mL 上清
               比, GST 基因的表达更强、 更迅速, 且 H ２O ２ 是诱导               液, 加 ３mLCCl ４ ＋CHCl ３    萃取剂( VCCl ４ ∶VCHCl ３ ＝
               GST 基因表达的主要信号分子, 在大丽轮枝菌毒素 ３∶１ ) 混匀, 再加 ５ mL 蒸 馏 水, 混 匀, ４０００r / min
               作用的下游起作用         [ １３ ] .                       离心 １min , 上层水相为 H ２O ２ 待测液.各取 １mL
                   嫁接是植物的一种人工营养繁殖方法, 即把一                       待测液, １ 份作空白, 加入终浓度为 ３U / mL 的过氧
               种植物的枝或芽移植到同种或另一种植物的茎或根                          化氢酶( CAT ), ３０℃ 保温１０min ; 另１ 份待测液, 加
               上, 使接在一起的 ２ 个部分长 成一个完整的植株. 等体积高 温 灭 活 的 CAT 酶 液. ２ 组 分 别 加１mL
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