摘要
为探究CVC1302调控生发中心B细胞发生体细胞高频突变的免疫机制，本研究将4-羟基-3-硝基苯乙酰基耦联鸡卵白蛋白（NP-OVA）混合免疫增强剂CVC1302后，利用ISA206乳化获得疫苗。BALB/c小鼠分为2组，分别后腿肌肉注射NP-ISA206和NP-CVC1302-ISA206，每只50 μg NP-OVA，免疫后14 d，利用流式分选获得生发中心B细胞，利用巢氏PCR扩增B细胞免疫球蛋白序列可变区VH186.2，Western blot检测诱导活化的胞苷脱氨酶（AID）、Pax5表达水平，β-actin作为内参，比较组间AID、Pax5表达差异；利用荧光定量PCR检测AID、Pax5基因转录水平。试验结果显示：CVC1302显著诱导生发中心B细胞免疫球蛋白序列VH186.2突变频率，试验组W33L突变频率为62.2%，而对照组仅为20.25%；CVC1302可提升AID蛋白、Pax5蛋白表达水平，其中试验组AID蛋白相对表达水平为0.72，对照组仅为0.16，试验组Pax5蛋白相对表达水平为0.62，对照组仅为0.26；CVC1302增强AID基因、Pax5基因转录水平，相较于对照组分别提高2.36、4.13倍。推断CVC1302依赖Pax5介导AID表达，调控生发中心B细胞发生体细胞高频突变。
机体感染病原体或者接受免疫后，引流淋巴结内抗原特异性B细胞被激活迁移至初级淋巴小结，并在该处快速克隆增殖，进而形成生发中心（germinal center，GC
免疫增强剂CVC1302组分包含TLR和NOR激动剂。前期研
5周龄BALB/c雌性小鼠购自扬州大学；NP-OVA购自美国Bioscience Technologies公司；免疫增强剂CVC1302为笔者所在团队制备所得；Montanid
本研究参照文献［
免疫后14 d，采集小鼠腹股沟淋巴结，用PBS冲洗3次，将淋巴结置于70 μm滤网上进行研磨，获得单个淋巴细胞。细胞先利用B细胞负选磁珠进行初次分选，随后用anti-GL-7-PE进行染色，用流式分选仪分选获得GC B细胞，一部分细胞提取RNA，利用Real-time PCR检测AID转录水平；一部分细胞利用试剂盒提取蛋白，利用Western blot检测AID表达水平。
分选获得的GC B细胞利用试剂盒提取基因组DNA，通过巢氏PCR扩增VH186.2片段，引物见
目的基因 Target gene | 引物名称 Primer name | 引物序列（5′-3′） Primer sequences （5′-3′） |
|---|---|---|
| VH186.2 |
外部引物-F Outer primer-F |
GTGACAACAATGATTAGACCCCTG AGCTCTATCATGCTCTTCTTGGCA |
|
外部引物-R Outer primer-R | ||
|
内部引物-F Inner primer-F |
GTGACAACAATGATTAGACCCCTG AGATGGAGGCCAGTCAGGGAC | |
|
内部引物-R Inner primer-R |
外部引物PCR程序为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行25个循环；72 ℃延伸10 min。内部引物PCR程序为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共进行25个循环；72 ℃延伸10 min。跑胶回收扩增的VH186.2片段并连接到pMD18-T载体（Takara）上利用T7引物进行测序；测序结果利用IgBlast（NCBI）进行分析统计。
将分选获得的2组GC B细胞分别用Trizol提取RNA，反转为cDNA后，利用Real-time PCR分别检测基因AID和Pax5转录水平，以β⁃actin作为内参基因，试验所涉及的基因引物见
| 目的基因 Target gene | 引物序列（5′-3′） Primer sequences （5′-3′） | 退火温度/℃ Annealing temperature |
|---|---|---|
| β⁃actin | CACTGCCGCATCCTCTTCC/CAATAGTGATGACCTGGCCGT | 53 |
| AID | GGAGAGATAGTGCCACCTCC/TCTCAGAAACTCAGCCACGT | |
| Pax5 | CACAGTCCTACCCTATTGTCAC/TCCAGAAAATTCACTCCCAGG |
取相同数目分选的GC B细胞置于冰上，加入蛋白裂解液，冰上裂解约30 min，每10 min在震荡仪上混匀涡旋1次。将样品置于离心机4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，加入5×SDS上样缓冲液，100 ℃作用10 min，进行SDS-PAGE和Western blot。分别利用AID、Pax5一抗37 ℃作用1 h；PBST洗涤后，HRP-羊抗兔IgG 37 ℃作用1 h，洗涤3次后，将高敏型ECL化学发光试剂滴加至目的条带大小处，利用化学发光成像仪观察拍照。图片利用Image J进行灰度分析，比较组间AID条带灰度值/β-actin条带灰度值和Pax5条带灰度值/β-actin条带灰度值。
考虑到抗体亲和力成熟与体细胞高频突变相关联，因此，小鼠免疫后14 d，制备淋巴结细胞，流式分选GC B细胞，并利用巢氏PCR对VH186.2片段进行测序分析。由
图1 CVC1302 诱导VH186.2片段突变
Fig.1 CVC1302 induced mutation of VH186.2
A：VH186.2片段占比；B：W33L突变频率；C：VH186.2片段氨基酸突变频率。A： The percentage of VH186.2； B： The mutation ratio of W33L； C： The mutation ratio of amino acid of VH186.2.
考虑到体细胞高频突变主要由AID介导，本研究比较分析NP-CVC1302-ISA206与NP-ISA206对照组诱导AID转录与表达水平。由
图2 CVC1302处理下GC B细胞AID基因转录水平
Fig.2 CVC1302 regulates the transcription level of AID in GC B cells
**表示P<0.01，差异极显著；***表示P<0.001，差异极显著。下同。** represent extremely significant differences between groups （P<0.01）；*** represent extremely significant differences between groups （P<0.001）.The same as below.
图3 CVC1302处理下GC B细胞AID表达水平
Fig.3 CVC1302 regulates the expression level of AID in GC B cells
A：AID蛋白表达；B：AID蛋白相对表达水平。A：AID protein expression； B： Relative expression level of AID protein.
小鼠免疫后14 d，取腹股沟淋巴结，流式分选获得GC B细胞，分别利用Real-time PCR和Western blot分别检测Pax5转录和表达水平。由
图4 CVC1302处理下GC B细胞Pax5基因转录水平
Fig.4 CVC1302 regulates the transcription level of Pax5 in GC B cells
图5 CVC1302处理下GC B细胞Pax5表达水平
Fig.5 CVC1302 regulates the expression level of Pax5 in GC B cells
A：Pax5蛋白表达；B：Pax5蛋白相对表达水平。A： Pax5 protein expression； B： Relative expression level of Pax5 protein.
免疫增强剂的研制注重于抗体水平及其持续期的检测，然而高亲和力的抗体可以更高效地识别并中和病原体，以抵抗高毒力病原体感染。文献中关于免疫增强剂调控AID也仅限于其表达量的变
位于生发中心暗区的GC B细胞增殖分裂，与此同时，AID作用于单链DNA，使GC B细胞重链和轻链的V区基因发生SHM。突变后的GC B细胞间BCR亲和力存在差异，进入明区后，经过FDC和Tfh细胞的双重辅助后，具有高亲和力BCR的B细胞分化为浆细胞，其分泌的抗体对抗原具有高亲和力，此现象为亲和力成
参考文献References
VICTORA G D， NUSSENZWEIG M C. Germinal centers［J］. Annual review of immunology， 2012，30：429-457. [百度学术]
YOUNG C， BRINK R. The unique biology of germinal center B cells［J］. Immunity， 2021，54（8）：1652-1664. [百度学术]
MAYER C T， GAZUMYAN A， KARA E E， et al. The microanatomic segregation of selection by apoptosis in the germinal center［J/OL］. Science，2017，358（6360）：eaao2602［2023-12-15］. https：//doi.org/10.1126/science.aao2602. [百度学术]
WANG J H. The role of activation-induced deaminase in antibody diversification and genomic instability［J］. Immunologic research， 2013，55（1/2/3）：287-297. [百度学术]
YU K F. AID function in somatic hypermutation and class switch recombination［J］. Acta biochimica et biophysica sinica， 2022，54（6）：759-766. [百度学术]
CHEN Z G， WANG J H. Signaling control of antibody isotype switching［J］. Advances in immunology， 2019，141：105-164. [百度学术]
YEAP L S， MENG F L. Cis- and trans-factors affecting AID targeting and mutagenic outcomes in antibody diversification［J］. Advances in immunology， 2019，141：51-103. [百度学术]
LIN K I， ANGELIN-DUCLOS C， KUO T C， et al. Blimp-1-dependent repression of Pax-5 is required for differentiation of B cells to immunoglobulin M-secreting plasma cells［J］. Molecular and cellular biology， 2002，22（13）：4771-4780. [百度学术]
SCHRADER C E， LINEHAN E K， MOCHEGOVA S N， et al. Inducible DNA breaks in Ig S regions are dependent on AID and UNG［J］. The journal of experimental medicine，2005，202（4）：561-568． [百度学术]
CHEN J， YU X M， ZHENG Q S， et al. The immunopotentiator CVC1302 enhances immune efficacy and protective ability of foot-and-mouth disease virus vaccine in pigs［J］. Vaccine， 2018，36（52）：7929-7935. [百度学术]
DU L P， CHEN J， HOU L T， et al. Long-term humoral immunity induced by CVC1302-adjuvanted serotype O foot-and-mouth disease inactivated vaccine correlates with promoted T follicular helper cells and thus germinal center responses in mice［J］. Vaccine， 2017，35（51）：7088-7094. [百度学术]
DU L P， HOU L T， YU X M， et al. Pattern-recognition receptor agonist-containing immunopotentiator CVC1302 boosts high-affinity long-lasting humoral immunity［J/OL］. Frontiers in immunology， 2021，12：697292［2023-12-15］. https：//doi.org/10.3389/fimmu.2021.697292. [百度学术]
RIVERA C E， ZHOU Y L， CHUPP D P， et al. Intrinsic B cell TLR-BCR linked coengagement induces class-switched， hypermutated， neutralizing antibody responses in absence of T cells［J/OL］. Science advances，2023，9（17）：eade8928［2023-12-15］. http：//doi.org/10.1126/sciadv.ade8928. [百度学术]
GITLIN A D， MAYER C T， OLIVEIRA T Y， et al. T cell help controls the speed of the cell cycle in germinal center B cells［J］. Science，2015，349（6248）：643-646． [百度学术]
NAGAOKA H， TRAN T H， KOBAYASHI M， et al. Preventing AID， a physiological mutator， from deleterious activation： regulation of the genomic instability that is associated with antibody diversity［J］. International immunology， 2010，22（4）：227-235. [百度学术]
CHEN D Y， WANG Y， VIJAY G K M， et al. Coupled analysis of transcriptome and BCR mutations reveals role of OXPHOS in affinity maturation［J］. Nature immunology，2021，22（7）：904-913． [百度学术]