摘要
为进一步开展淮南猪分子选育，提升其生长速度和瘦肉率等经济性状，选取淮南猪胚胎期（days post coitus， dpc）第38、58、78天和出生后第21天4个发育阶段的淮南公猪背最长肌，开展全基因组甲基化测序并通过信号通路富集分析筛选调控肌肉发育的甲基化差异的候选基因。结果显示，基因主体的CpG甲基化程度高于基因上下游2 kb序列的CpG甲基化，基因组元件中内含子、3' UTR和重复序列等甲基化程度最高。随着发育时间的增加，基因主体的CpG甲基化水平逐渐下降，上下游2 kb则是下降-上升-下降趋势。基因组元件中内含子区、3' UTR区和重复序列的甲基化水平都逐渐下降，启动子区则为下降-上升-下降趋势。信号通路富集分析显示，在淮南猪相邻的发育阶段38~58 dpc、58~78 dpc、78 dpc~21 d三者间的差异化均达到极显著水平，黏着斑信号通路存在CpG甲基化差异基因，且达到极显著水平（P值分别为0.000 9、0.000 4、0.000 1），细胞黏附连接信号通路存在CHH甲基化差异基因，且分别达到显著或极显著水平（P值分别为0.013 2、0.012 8、0.000 5），生物信息学分析结果显示，在2个信号通路中筛选到辅肌动蛋白Α4基因（actinin-4， ACTN4）和成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor， FGFR1）基因。ACTN4基因调节肌动蛋白结合过程，在4个发育阶段的甲基化水平分别为55.75%、11.18%、10.18%、59.75%，FGFR1基因和肌肉细胞分化相关，在4个发育阶段的甲基化水平分别为0.81%、0.78%、7.52%、0.44%。以上结果表明，在淮南猪肌肉组织不同发育阶段筛选到的2个甲基化差异基因ACTN4和FGFR1可作为淮南猪肌肉发育候选基因进行分子育种。
DNA甲基化是一种表观遗传修饰方式，通过DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）把甲基基团添加到5' C位点上而形
猪的骨骼肌在胚胎期包括2个发育阶段，即初级肌纤维和次级肌纤维的形成。妊娠后第14~22天经历体节-轴旁中胚层-生肌节的发育过程，第35天左右形成初级肌纤维，第49天左右达到增殖顶峰，并持续至妊娠第60天。次级肌纤维约在猪妊娠第45~90天形成并分化发育，并在妊娠第75天左右达到顶
淮南猪于1986年被列入河南省地方优良畜禽品种志，主产于河南信阳地区，归属于黄淮海黑猪、华北型。在肉质性状方面，淮南猪具有肌纤维细、肉色鲜红、肌内脂肪含量高等优
选取正常怀孕第38、58、78天（分别记为H38 dpc、H58 dpc、H78 dpc）的淮南母猪，屠宰后每头母猪分别选取3头公猪胚胎，采集背最长肌组织；屠宰21日龄（记为H21）断奶淮南公猪3头并采背最长肌组织。分别提取DNA后进行质量检测，-20 ℃储存备用。
1）对未甲基化修饰位点进行处理，构建文库。对插入片段长度和有效浓度检测合格后，加入一定比例的lambda DNA作为阴性对照，将DNA随机打断到200~300 bp后进行末端修复、加A尾，并连接经过甲基化修饰的测序接头。利用EZ DNA Methylation Gold Kit试剂盒（Zymo Research）进行重亚硫酸盐处理，经过PCR扩增后获得测序文库。
2）甲基化测序及生物信息学分析。不同文库送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司开展Illumina Hiseq双末端测序。测序完成后利用DSS（2.12.0）、Goseq（2.13）、KOBAS（2.0）等软件分别进行甲基化序列类型比例统计、不同发育阶段全基因组甲基化水平差异分析、基因上下游CpG甲基化差异分析、各基因组元件CpG甲基化差异分析、信号通路分析，分析所用的参考基因组网址为ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release-81/fasta/sus_scrofa/dna/。登录信号通路查询网站（https：//www.genome.jp/kegg/），在达到显著性差异的信号通路中筛选影响肌肉发育的候选基因。
所有样品测序位点数如
样本名称 Samples | 位点数 Sites number | 平均覆盖深度（倍） Sites coverage mean |
|---|---|---|
| H38dpc | 2 067 668 013 | 22.56 |
| H58dpc | 2 061 696 680 | 20.99 |
| H78dpc | 2 064 819 745 | 20.74 |
| H21 | 2 083 321 461 | 22.55 |
C位点甲基化主要以CpG、CHG、CHH（H表示A、C、T）3种序列形式存在。对淮南猪胚胎期38、58、78 d及出生21 d 4个阶段进行甲基化测序，分析发现4个阶段CpG上的甲基化C位点比例分别为27.75%、27.23%、27.51%、30.34%，分别占3种甲基化序列的96.42%、96.67%、96.21%、94.96%（
图1 不同C位点甲基化比例
Fig.1 The ratio of methylated cytosines in CpG， CHG and CHH
不同颜色代表3种不同甲基化形式，各部分面积的大小代表相应甲基化形式C位点的比例。The color represents methylated cytosines in different contexts， the area size represents ratio of methylated cytosines in different contexts.
为了解淮南猪不同发育阶段总体的甲基化差异情况，在全基因组范围内通过circos图比较了各个发育阶段的甲基化水平（
图2 不同阶段CpG甲基化水平比较
Fig.2 DNA mCpG levels at different developmental stages
外圈表示处理组甲基化水平，中圈表示样本组间甲基化水平差异，内圈表示对照组甲基化水平；不同颜色表示甲基化水平高低，热图表示样本间甲基化水平差异程度。From outside to inside presents DNA methylation levels in treatment group， differences in DNA methylation levels between samples， DNA methylation levels in control group， respectively； the color chart indicates the DNA methylation levels， and heat map indicates DNA methylation differences.
对C位点在各种基因主体（genebody）及转录起始和终止位点上下游2 kb序列的平均甲基化水平进行统计，结果如
图3 基因上下游2 kb的甲基化分布
Fig.3 DNA methylation distribution in upstream 2 kb and downstream 2 kb of genebody regions
基因区域1为转录起始位点上游2 kb序列，2为基因主体，3为终止位点下游2 kb序列。红色、蓝色、绿色分别代表CpG、CHG、CHH甲基化。Regions 1-3 represent sequences of upstream 2 kb， genebody and downstream 2 kb respectively. The red， blue and green represent methylation levels of CpG， CHG and CHH， respectively.
对淮南猪不同发育阶段的基因不同区域的平均甲基化水平两两比较，结果显示：随着发育时间的增加，基因主体的CpG甲基化水平呈逐渐下降趋势，上下游2 kb序列的CpG甲基化水平则是下降-上升-下降趋势（
图4 不同发育阶段基因上下游2 kb的CpG甲基化差异比较
Fig.4 DNA mCpG differences in upstream 2 kb and downstream 2 kb of genebody regions at different developmental stages
区域1为转录起始位点上游2 kb序列，2为基因主体，3为终止位点下游2 kb序列。 Regions 1-3 represent sequences of upstream 2 kb， genebody and downstream 2 kb respectively.
对C位点在各种基因组功能区域（如启动子、外显子、内含子、CpG岛、重复序列，其中启动子区为转录起始位点上游2 kb的区域）的平均甲基化水平进行统计，结果显示：总体上mCpG含量远远高于其他形式的甲基化。mCpG在基因各区域的分布情况为：内含子、3' UTR和重复序列甲基化程度最高，外显子、CpG岛和CpG岛外沿次之，启动子区和5' UTR甲基化程度最低（
图5 不同基因组元件上的甲基化水平分布
Fig.5 DNA methylation distribution in different elements
横坐标中1~8分别为CpG岛、CpG岛外沿、启动子区、5'非翻译区、外显子区、内含子区、3' 非翻译区、重复序列。下同。 1-8 represent CpG island， CpGI shore， promoter， 5'-UTR， exon， intron， 3' UTR and repeat sequences.The same as below.
对不同发育阶段的C位点在不同功能区域（启动子、外显子、内含子、CpG岛、重复序列，其中启动子区为转录起始位点上游2 kb的区域）的平均甲基化水平进行对比，结果显示：随着发育时间的增加，淮南猪的内含子区、3' UTR区和重复序列的CpG甲基化水平都呈逐渐下降趋势，启动子区则是下降-上升-下降趋势（
图6 不同发育阶段的基因组元件甲基化水平两两比较
Fig.6 Comparative analysis of DNA methylation levels in different elements at different developmental stages
A：H38 dpc vs H58 dpc； B： H58 dpc vs H78 dpc； C： H78 dpc vs H21.
通过信号通路公共数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）富集分析，在黏着斑（ssc04510：Focal Adhesion）信号通路发现，淮南猪相邻的发育阶段均存在CpG甲基化差异基因（
图7 淮南猪CpG甲基化差异基因的KEGG富集代谢通路分析
Fig.7 KEGG pathway analysis of mCpG differential methylation genes in Huainan pigs
A：H38 dpc vs H58 dpc； B： H58 dpc vs H78 dpc； C： H78 dpc vs H21； 点的大小表示此信号通路中CpG甲基化差异基因个数多少，而点的颜色对应于不同的P值范围 The size of dots represents the number of mCpG differential methylation genes in pathway， the color of dots represent different P value ranges.
图8 ACTN4（A）和FGFR1（B）基因甲基化水平
Fig. 8 Methylation levels of ACTN4（A） and FGFR1（B） genes
本研究测序发现所有样品中CpG甲基化占所有甲基化形式的90%以上，这符合哺乳动物甲基化主要发生在CpG序列的C位点上这一规
猪的肌纤维总数在出生前就已经确定，因此，胚胎时期肌肉发育进程的差异会导致出生后产肉量的差异。一般而言，甲基化与基因表达呈现负相关，因此，在肌肉发育的不同阶段，肌肉发育相关基因甲基化与否及甲基化水平会影响其表达与否及表达量，从而直接影响肌纤维的生长发育并决定瘦肉率。本研究在淮南猪胚胎期与出生后21 d不同发育阶段间均发现了甲基化差异基因，并根据生物信息学筛选了2个候选基因ACTN4、FGFR1，其甲基化水平在4个发育阶段分别呈甲基化—去甲基化—甲基化和去甲基化—甲基化—去甲基化，从而影响该基因的表达。
细胞外基质与一个细胞的肌动蛋白细胞骨架之间的物理联系由被称为“黏着斑”的细胞器组成。本研究选取的4个肌肉发育阶段中，每2个相邻发育阶段的黏着斑信号通路都存在甲基化差异基因。候选基因ACTN4是新近发现的一种肌动蛋白交联蛋白，在运动细胞变皱膜中有较高的表达。表皮生长因子（endothelial growth factor）诱导的信号通路可引起α- ACTN4酪氨酸磷酸化，降低α-ACTN4与肌动蛋白的结合能力，使细胞骨架解体，从而有利于细胞迁移及胞质分
本研究筛选的胚胎期肌肉发育的相关基因及信号通路，有助于理解淮南猪早期肌肉发育的机制，并为下一步开展候选基因甲基化与表达的相关性研究奠定良好基础。
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