摘要
为解析间作相生相克作物对香葱生长及抗性的作用机制，设置C：香葱单作处理、F：相克处理组合（香葱/豌豆间作）和H：相生处理组合（香葱/番茄间作），比较分析香葱间作不同作物对根系内生微生物群落组成的影响。结果显示：unclassified_f_Xanthomonadaceae、独岛杆菌属 （Dokdonella）、黄杆菌属 （Flavobacterium）、unclassified_f_Alcaligenaceae、 德沃斯氏菌属（Devosia）细菌是香葱间作相生相克作物体系下香葱根系排名前5的共有优势内生细菌属；同时，嗜酸菌属 （Acidovorax）细菌是相克处理组合：香葱/豌豆间作体系下， 香葱根系中特有的优势内生细菌属。单镰刀菌属 （Fusarium）、炭疽菌属 （Colletotrichum）、Plectosphaerella、unclassified_o_Helotiales、新赤壳属 （Neocosmospora）真菌是香葱间作相生相克作物体系下香葱根系排名前5的共有优势内生真菌属；赤霉属 （Gibberella）和Acrocalymma属真菌是相生处理组合香葱/番茄间作体系下香葱根系中特有的优势内生真菌属； Dactylonectria和漆斑菌属 （Myrothecium）真菌是相克组合处理（香葱/豌豆）间作体系下香葱根系中特有的优势内生真菌属。结果表明，香葱间作不同作物塑造了香葱根系相异的内生微生物群落，香葱间作相生作物体系中，香葱根系中形成了具有促进作物生长、提高作物抗性功能的内生微生物群落；而香葱间作相克作物体系中，香葱根系中形成了以病原微生物为主体的内生微生物群落，这可能是香葱间作不同作物产生相生相克现象的重要机制之一。
相生相克是一种普遍存在的生物学现象，指的是一个生物体产生的生物化学物质会影响另一个生物体的生长、存活和繁
香葱（Allium ascalonicum L.）为百合科葱属植物，是重要的香料蔬菜和调味品。除了具有蔬菜的营养价值外，香葱还具有药用价值，被认为具有祛痰解热、抗菌抗病毒、促进消化、降低血脂、调节血糖、增强免疫力以及抑制肿瘤生长等功
目前的研究发现，植物根际土壤微生物群落的组成和功能与植物对土壤传播病害的抗性之间存在密切关
但目前间套作栽培体系中相生相克发生的机制，尤其是微生物生态学方面的作用机制仍不明确。为此，本研究设置香葱单作、相生组合（香葱/番茄间作）和相克组合（香葱/豌豆间作）栽培模式处理，比较分析香葱间作不同作物对根系内生微生物群落组成的影响，解析香葱间作相生相克作物对根系内生微生物群落结构组成的塑造特征，旨在探究香葱间作不同作物对其生长及抗性的影响，为构建香葱健康生态生产技术体系及提高香葱产量与品质提供理论依据和技术支撑。
试验于2021年1月在广西大学农学院蔬菜基地（108°17'25"E，22°51'02"N）进行。试验材料均购于广西壮族自治区南宁市蔬菜种子市场，香葱（Allium ascalonicum）品种为上海四季小香葱819，豌豆（Pisum sativum L.）品种为奇珍76豌豆；番茄（Solanum lycopersicum L.）品种为芳萱丽粉番茄。
试验地土壤理化性状：pH 5.68，有机质8.92 g/kg，碱解氮 15.27 mg/kg，速效磷0.67 mg/kg，速效钾82.8 mg/kg，全氮0.55 g/kg，全磷0.67 g/kg，全钾 7.51 g/kg。
设置3个处理，C：香葱单作处理、F：相克处理组合（香葱/豌豆间作）和H：相生处理组合（香葱/番茄间作）。每个处理5次重复，其中， 单作为仅种植香葱。香葱/豌豆间作、香葱/番茄间作的除草灌溉、病虫害防治、施肥等按常规方法进行相同管理。
2021年3月，在每个栽培处理中随机选取3株生长状况良好的香葱植株，在以植株为中心、半径12 cm的圆对周围进行松土，然后握住植株茎基部拔出植株；按照抖根
样品DNA提取、PCR扩增和Illumina MiSeq测序操作委托上海美吉生物医药科技有限公司完成 。DNA提取：利用FastDNAⓇSpin Kit for Soil试剂盒（MP Biomed-icals，U.S）抽提总DNA，使用NanoDrop2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，U.S）测定DNA浓度和纯度，最后凝胶电泳检测DNA提取质量；PCR扩增的引物和测序类型详见
引物类型 Primer type | 引物名称 Primer name | 引物序列（5′-3′） Primer sequence | 测序平台 Sequencing platform | 产物长度/bp Product length |
|---|---|---|---|---|
|
根系内生细菌 Root endophytic bacteria |
1192R 799F |
ACGGGCGGTGTGTRC AACMGGATTAGATACCCKG | MiSeq PE250 | 394 |
|
根系内生真菌 Root endophytic fungi |
1193R ITS1F ITS2R |
ACGTCATCCCCACCTTCC CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA GCTGCGTTCTTCATCGATGC | MiSeq PE250 | 350 |
采用Shannon指数表征内生微生物的多样性，用Ace指数和Chao1指数表征微生物的丰富度。所有指标的计算方法和结果均通过上海美吉生物医药技术有限公司所提供的I-sanger云统计分析平台进行统计分析。最后，再通过Excel 2019和IBM的SPSS Statistics 23统计分析软件进行数据分析。
1）不同栽培模式下香葱根系内生细菌OTUs分析。基于97%相似性水平对不同栽培模式样品序列进行聚类分析，结果（
栽培模式 Cultivation modes | OTUs | 不同分类阶元归类数量 Number of different taxonomic categories | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 门 Phylum | 纲 Class | 目 Order | 科 Family | 属 Genus | 种 Species | ||
| C | 715 | 20 | 40 | 114 | 202 | 340 | 519 |
| F | 656 | 19 | 33 | 101 | 177 | 306 | 472 |
| H | 634 | 22 | 38 | 105 | 181 | 317 | 468 |
| 总计 Total | 886 | 23 | 43 | 127 | 223 | 390 | 619 |
注： C：香葱单作处理；F：相克处理组合（香葱/豌豆间作）； H：相生处理组合（香葱/番茄间作）。下同。Note： C： Chive monoculture； F： Chive/peas intercropping system； H ： Chive/tomato intercropping system. The same as below.
2）间作相生相克作物对香葱根系内生细菌Alpha 多样性的影响。由
栽培模式 Cultivation modes | 香农指数 Shannon index | Ace指数 Ace index | Chao 1指数 Chao 1 index | 覆盖率/% Coverage |
|---|---|---|---|---|
| C | 4.55±0.11a | 592.4±34.06a | 604.10±46.81a | 99 |
| F | 4.27±0.46a | 597.0±69.26a | 604.80±77.24a | 99 |
| H | 4.30±0.34a | 609.1±87.50a | 595.00±42.87a | 99 |
3）间作相生相克作物对香葱根系内生细菌群落组成的影响。
①内生细菌在门分类水平上的群落组成。由
图1 不同栽培模式下香葱植株根系内生细菌门分类水平群落相对分布
Fig.1 Relative distribution of endophytic bacteria at phylum level in roots of chives under different cultivationmodes
②内生细菌在属分类水平上的群落组成。由
图2 不同栽培模式下香葱植株根系内生细菌属分类水平群落相对分布
Fig.2 Relative distribution of endophytic bacteria at genus level in the root system of chives under different cultivation modes
综上，unclassified_f_Xanthomonadaceae、独岛杆菌属、黄杆菌属、unclassified_f Alcaligenaceae、德沃斯氏菌属、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、假单胞菌属、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、鞘氨醇盒菌属（Sphingopyxis）、不粘杆菌属（Asticcacaulis）、鞘脂菌属（Sphingobium）、unclassified_f_Comamonadaceae细菌是香葱间作相生相克作物以及单作栽培体系中香葱植株根系共有的优势内生细菌属。Uliginosibacterium、嗜酸菌属（Acidovorax） 、unclassified_f_Xanthobacteraceae、柄杆菌属（Caulobacter）、unclassified_f_Rhizobiaceae、unclassified_f_Enterobacteriaceae细菌是相克组合（香葱/豌豆间作）栽培体系中香葱植株根系特有的优势内生细菌属；链霉菌属（Streptomyces）、Lechevalieria、拉恩氏菌属（Rahnella）和游动放线菌属（Actinoplanes）是香葱植株单作根系特有的优势内生细菌属。
1）不同栽培模式下香葱根系内生真菌OTUs分析。在香葱单作和间作相生相克作物体系中，基于97%相似性水平对样品序列进行分类聚类分析（
栽培模式 Cultivation modes | OTUs | 不同分类阶元归类数量 Numbers of different taxonomic categories | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 门 Phylum | 纲 Class | 目 Order | 科 Family | 属 Genus | 种 Species | ||
| C | 301 | 8 | 24 | 44 | 79 | 108 | 142 |
| F | 284 | 7 | 24 | 42 | 74 | 104 | 143 |
| H | 249 | 9 | 22 | 38 | 65 | 98 | 140 |
| 总计Total | 498 | 9 | 30 | 58 | 118 | 170 | 240 |
2）间作相生相克作物对香葱根系内生真菌Alpha 多样性的影响。由
栽培模式 Cultivation modes | 香农指数 Shannon index | ACE指数 ACE index | Chao 1指数 Chao 1 index | 覆盖率/% Coverage |
|---|---|---|---|---|
| C | 2.48±0.35a | 166.40±26.97a | 171.80±25.75a | 99 |
| F | 2.68±0.08a | 153.80±20.32a | 151.90±19.86a | 99 |
| H | 2.08±0.09b | 135.70±31.42a | 135.60±29.87a | 99 |
3）间作相生相克作物对香葱根系内生真菌群落组成的影响。
①内生真菌在门分类水平上的群落组成。由
图3 不同栽培模式下香葱植株根系内生真菌门分类水平群落相对分布
Fig.3 Relative distribution of endophytic fungi at phylum level iin roots of chives under different cultivation modes
与之相比，相克组合（香葱/豌豆间作）栽培模式下，香葱植株根系优势内生真菌门类丰度占比由高至低依次分别为子囊菌门（68.17%）、罗兹菌门（Rozellomycota，8.57%）、unclassified_k_Fungi（8.14%）、球囊菌门（6.85%）、担子菌门（4.24%）、壶菌门（Chytridiomycota，2.05%）和油壶菌门（1.98%）。
此外，香葱单作栽培体系中，香葱植株根系优势内生真菌门类丰度占比由高至低依次分别为子囊菌门（68.68%）、球囊菌门（22.08%）、担子菌门（4.92%）、油壶菌门（2.33%）和unclassified_k_Fungi（1.57%）。
与相生组合（香葱/茄间作）处理相比，罗兹菌门和壶菌门真菌是相克组合（香葱/豌豆间作）栽培体系中香葱植株根系中特有的优势内生真菌门类；与香葱单作相比，虽然相生组合（香葱/番茄间作）栽培模式中香葱根系中不存在特有的优质真菌门类，但香葱植株根系中子囊菌门真菌丰度占比高于相应的单作栽培处理。
②内生真菌在属分类水平上的群落组成。相生组香葱/番茄间作栽培体系中，香葱植株根系优势内生真菌属（相对丰度占比大于1%）有12个，丰度占比前5的属为炭疽菌属（Colletotrichum，28.43%）、镰刀菌属（Fusarium，27.93%）、Plectosphaerella（7.87%）、油壶菌属（Olpidium，7.25%）、unclassified_o_Helotiales（4.51%）。相克（香葱/豌豆）作物间作栽培体系中，香葱植株根系优势内生真菌属（相对丰度占比大于1%）有15个，丰度占比前5的为Plectosphaerella（15.78%）、镰刀菌属（Fusarium，13.65%）、unclassified_o_Helotiales（10.29%）、unclassified_p_Rozellomycota（8.57%）、unclassified_k_Fungi（8.14%）、摩西管柄囊霉菌属Funneliformis（5.85%）。此外，香葱单作栽培体系中，香葱植株根系优势内生真菌属（相对丰度占比大于1%）有14个，丰度占比前5的为镰刀菌属（Fusarium，20.95%）、炭疽菌属（Colletotrichum，17.66%）、摩西管柄囊霉菌属（Funneliformis， 9.60%）、新赤壳属（Neocosmospora，8.68%）、Rhizophagus（7.40%）。
综上，镰刀菌属、炭疽菌属、unclassified_o_Helotiales、新赤壳属、unclassified_k_Fungi、unclassified_p_Ascomycota、油壶菌属（Olpidium）、丝核菌属（Rhizoctonia）真菌是香葱相生相克间作以及单作栽培体系中，香葱植株根系共有的优势内生真菌属；赤霉菌属和Acrocalymma属真菌是相生（香葱/番茄）作物间作栽培体系中香葱植株根系特有的优势内生真菌属；unclassified_p_Rozellomycota、unclassified_o_Pleosporales、Dactylonectria、漆斑菌属（Myrothecium）、unclassified_p_Chytridiomycota属真菌是相克（香葱/豌豆）作物间作栽培体系中香葱植株根系特有的优势内生真菌属。unclassified_f_Glomeraceae、球囊霉属、unclassified_f_Ceratobasidiaceae属真菌是香葱单作栽培体系中香葱植株根系特有的优势内生真菌属。
图4 不同栽培模式下香葱植株根系内生真菌属分类水平群落相对分布
Fig.4 Relative distribution of endophytic fungi at genus level inin root of chives under different cultivationmodes
植物内生菌广泛存在于植物各器官组织中，但根部内生细菌数量远超过其他组织，表明根部在植物微生物相互作用中的重要
与香葱单作相比，香葱无论是间作相生（番茄）抑或相克（豌豆）作物均没有改变香葱植株根系内生细菌群落门分类组成，仅改变了植株根系优势内生细菌群落门分类组成的丰度占比。其中，香葱相生间作体系中，香葱根系中放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidota）细菌的丰度占比均高于相克间作处理；前人的研究已证实，放线菌门和拟杆菌门细菌对侵染性病害具有十分明显的防治作
与香葱相生组合（香葱/番茄间作）体系相比，香葱相克组合（香葱/豌豆间作）不仅显著改变了内生真菌群落多样性，而且富集了相生组合间作体系中缺乏的、相克间作体系中香葱根系特有的罗兹菌门（Rozellomycota）和壶菌门（Chytridiomycota）真菌；但其中油壶菌门 （Olpidiomycota）真菌的丰度占比低于相应的相生组合。Dactylonectria属和漆斑菌属 （Myrothecium）真菌是香葱相克间作组合中香葱根系特有的内生真菌属；而漆斑菌属 （Myrothecium）真菌侵染植物会引起系统性萎蔫症状或局部性坏死和腐
Unclassified_f_Xanthomonadaceae、独岛杆菌属 （Dokdonella）、黄杆菌属 （Flavobacterium）、unclassified_f_Alcaligenaceae、 德沃斯氏菌属（Devosia）细菌是香葱相生相克体系下香葱根系排名前5的共有优势内生细菌属；同时，嗜酸菌属 （Acidovorax）细菌是相克（香葱/豌豆）组合间作体系下香葱根系中特有的优势内生细菌属。镰刀菌属 （Fusarium）、炭疽菌属 （Colletotrichum）、Plectosphaerella、unclassified_o_Helotiales、新赤壳属 （Neocosmospora）真菌是香葱间作相生相克作物体系下，香葱根系排名前5的共有优势内生真菌属；Gibberella和Acrocalymma属真菌是相生组合（香葱/番茄间作）体系下， 香葱根系中特有的优势内生真菌属； Dactylonectria和漆斑菌属 （Myrothecium）真菌是相克组合（香葱/豌豆间作）体系下， 香葱根系中特有的优势内生真菌属。
综上，香葱间作不同作物塑造了香葱根系相异的内生微生物群落组成，相生组合间作体系中，香葱根系中形成了具有促进生长、提高抗性功能的内生微生物群落；而相克组合间作体系中，香葱根系中形成了以病原微生物为主体的内生微生物群落，这可能是香葱间作不同作物产生相生相克现象的重要机制之一。
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