摘要
为深入研究富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat，LRR）在机体先天免疫过程中的作用机制，以莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为模式生物，通过生物信息学预测分析CrLRR-1蛋白的二级结构、亲水性及免疫原性等理化性质，人工设计并合成特异性肽段，与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联后免疫新西兰白兔。结果显示：采用间接ELISA法测定抗血清效价达到1∶512 000，将抗血清依次经Protein A和抗原亲和纯化后得到CrLRR-1蛋白多克隆抗体；利用免疫印迹与免疫荧光检测制备的抗体，该抗体可特异性识别莱茵衣藻内源LRR-1蛋白，且CrLRR-1蛋白主要定位于细胞膜。结果表明，成功制备CrLRR-1蛋白多克隆抗体。
富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat，LRR）长度为20~30个氨基酸，可分为高度保守段（highly conserved segment，HCS）和可变段（variable segment，VS），HCS通常由11个氨基酸残基组成：LxxLxLxxNxL，其中L为Leu、Ile、Val或Phe；N是Asn、Thr、Ser或Cy
LRR结构域在许多与动植物先天免疫相关的蛋白质中是进化保守的。作为第一道防线，先天免疫反应是通过感知病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）启动的。在植物中，含有核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）的NBS-LRR蛋白依赖LRRs识别多种病原
莱茵衣藻属于单细胞真核藻类，具有成本低、培养简单、生长周期短等优点，是一种成熟的模式生物。本研究利用莱茵衣藻内源LRR-1肽段免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，旨在为深入研究LRR型蛋白功能及其分子机制提供材料。
水稻（Oryza sativa L.）叶片，莱茵衣藻野生型藻株21gr和突变藻株lrr-1为江汉大学遗传与生物技术研究中心实验室保存。新西兰白兔（体质量2.0 kg）购于湖北省实验动物中心。
在NCBI网站检索莱茵衣藻CrLRR-1同源蛋白，分析该蛋白特异性，通过PHD、DSC、MLRC和Sec.Cons对CrLRR-1的二级结构进行分析，利用TMHMM、SMART预测CrLRR-1跨膜区和结构域，使用DNA Star软件分析CrLRR-1蛋白亲水性、免疫原性及抗原表位暴露性，根据以上分析选择亲水性好、抗原性指数高的肽段。多肽的合成、纯化及偶联KLH委托武汉爱博泰克生物科技公司完成。
免疫动物为2.0 kg左右的雄性新西兰白兔，免疫前取耳缘静脉血作为阴性对照。第1次免疫取200 μg纯化好的CrLRR-1多肽抗原与等体积完全弗氏佐剂（Sigma F5881）混匀至完全乳化，进行颈背部皮下注射6~8个点。首次免疫11 d后进行第2次免疫，取100 μg多肽与等体积不完全弗氏佐剂（Sigma F5506）混匀并充分乳化，在颈背部皮下免疫4个点，接着每隔2周进行1次加强免疫，连续3次，免疫方法、剂量均与第2次相同。全程共免疫5次，免疫结束后第12天进行动脉取血100 mL左右，4 ℃离心收集上层血清。
用包被液（Solarbio SEKF105）稀释CrLRR-1多肽至1 μg/mL作为包被抗原，以100 μL/孔包被酶标板，4 ℃过夜。用含0.05% Tween-20的PBST洗涤3次，每孔加入200 μL封闭液（含5% BSA），37 ℃孵育2 h，PBST洗涤3次。待测抗血清为一抗，从1∶2 000开始2倍梯度稀释至1∶512 000，并设同等稀释度的阴性兔血清做对照，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次后每孔加入100 μL辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔二抗（1∶20 000稀释），37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次。每孔加入100 μL TMB显色剂，37 ℃避光反应10 min，每孔加入50 μL 终止液，即刻用酶标仪测定波长在450 nm下的吸光值。抗血清OD450 nm大于0.1，且与阴性对照血清OD450 nm比值大于2，其对应的最高稀释倍数即为抗血清效价。
首先采用Protein A纯化法，称取1.5 g Protein A SepharoseCL-4B填料于纯化柱，使用去离子水使其充分溶胀，加入Protein A结合缓冲液（0.1 mol/L Tris，150 mmol/L NaCl，pH 7.5）平衡填料，将CrLRR-1抗血清用结合缓冲液稀释后加入处理好的纯化柱，4 ℃过夜结合。用结合缓冲液洗去纯化柱中非特异性吸附的杂蛋白，加入0.1 mol/L（pH 2.7）甘氨酸洗脱液洗脱抗体，并立即用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）中和抗体。采用抗原亲和纯化法进一步纯化，将CrLRR-1多肽抗原结合到琼脂糖凝胶树脂上，使其专一性吸附CrLRR-1的抗体，按上述方法将抗体洗脱下来。
突变藻株lrr-1是笔者所在实验室通过向野生型藻株21gr基因组中引入随机插入突变的方式获得。首先利用RESDA-PCR（restriction enzyme site-directed amplification PCR）技术扩增出插入片段两侧的DNA序
收集细胞状态良好的野生型21gr和突变体lrr-1藻细胞，8% PFA固定细胞，使用0.5% NP40通透细胞2 min，将细胞轻滴在0.1% PEE处理过的载玻片上，室温下用山羊血清封闭1 h。一抗采用CrLRR-1抗体（1∶100稀释）和衣藻鞭毛膜蛋白（flagellar membrane glycoprotein 1B，FMG-1B）抗体，等量混合，37 ℃孵育4 h，二抗分别使用红色荧光素标记的羊抗兔二抗（Merck R37116）和绿色荧光素标记的羊抗小鼠二抗（Merck R37120），37 ℃避光孵育2 h，滴加Fluoromount-G（SBA-0100）防荧光淬灭剂后封片，激光共聚焦扫描显微镜下观察荧光信号并拍摄图像。
CrLRR-1在莱茵衣藻中的基因位点编号为Cre06.g302700（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/report/gene/Creinhardtii_v5_6/Cre06.g302700），CrLRR-1蛋白结构域分析如
图 1 CrLRR-1蛋白抗原表位预测分析
Fig. 1 Prediction and analysis of CrLRR-1 antigenice pitopes
A：CrLRR-1结构域预测Prediction of CrLRR-1 domains；B：CrLRR-1抗原性分析Analysis of CrLRR-1 antigenicity.
利用间接ELISA法测定CrLRR-1抗血清效价，结果如
图 2 间接ELISA法测定抗血清效价
Fig. 2 Determination of CrLRR-1 antiserum titer by indirect ELISA
突变藻株lrr-1的RESDA-PCR扩增结果如
图 3 lrr-1突变体验证与CrLRR-1抗体特异性检测
Fig. 3 Verification of lrr-1 mutant and detection of the specificity of CrLRR-1 antibody
A：突变藻株lrr-1的RESDA-PCR （A、P、S、T分别代表引物DegAluⅠ、DegPstⅠ、DegSacⅡ、DegTaqⅠ） RESDA-PCR of mutant lrr-1 （A，P，S and T represent primer DegAluⅠ，DegPstⅠ，DegSacⅡ，DegTaqⅠ）；B：野生型21gr和突变藻株lrr-1的反转录PCR RT-PCR of wild type 21gr and mutant lrr-1；C：CrLRR-1抗体特异性检测 Detection of CrLRR-1 antibody specificity.
由
图 4 免疫荧光检测CrLRR-1蛋白在莱茵衣藻中的亚细胞定位
Fig. 4 Analysis of CrLRR-1 protein subcellular localization in C. reinhardtii by immunofluorescence
由
图 5 CrLRR-1抗体检测水稻LRR蛋白
Fig. 5 Detection of LRR protein in O. sativa leaves by CrLRR-1 antibody
A：CrLRR-1蛋白369~386 aa在水稻LRR蛋白中保守性 Conservation of CrLRR-1 protein 369~386aa in O. sativa； B：水稻叶片总蛋白梯度免疫印迹检测 Western blot detection of total protein in O. sativa leaves.
抗体制备是研究目标基因的转录和表达、蛋白间相互作用、蛋白亚细胞定位及其生物学功能的基础。本研究通过生物信息学预测分析CrLRR-1蛋白的二级结构、亲水性、免疫原性、抗原表位暴露性以及与衣藻中其他蛋白的同源性等，以此为依据选取CrLRR-1蛋白369~386 aa区域，合成该特异性肽段与KLH偶联后免疫新西兰白兔。与天然抗原或重组蛋白相比，人工合成多肽的抗原表位优势富集，与载体蛋白偶联后不仅能增加抗原的大小，也能增强免疫性，更好地刺激机体产生抗
LRRs是与先天免疫相关的蛋白质中最常见的蛋白结构域之一，先天免疫在保护生物体免受内源性和外源性病原物入侵方面发挥重要作用。已有研究表明，LRRs主要作为特异性识别区域，参与生物体对病原物的感知与识
综上所述，本研究通过生物信息学预测分析莱茵衣藻LRR-1蛋白理化性质，设计并合成特异性多肽，与KLH偶联后免疫新西兰白兔，成功制备了效价高、特异性好的CrLRR-1多克隆抗体，并应用该抗体特异性识别了水稻内源LRRL1蛋白。该抗体的制备可为后续深入研究LRR型蛋白功能，阐明其作用机制奠定材料基础。
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