摘要
为探究噬菌肽在食品加工链中的应用前景，以1种含有37个氨基酸的新型噬菌肽SEYT4为研究对象，分析其结构特性，并选择食品加工链中常见的致病细菌，在不同温度、盐度及pH下进行杀菌试验，测定SEYT4的杀菌谱、杀菌效率及杀菌特性，利用C57BL/6雌性小鼠评估SEYT4的安全性，并通过模拟被致病菌污染的叶菜和厨具，探究SEYT4清除食品链中致病菌的效果。结果显示：噬菌肽SEYT4是1个发夹状的双α-螺旋结构，分子质量约为4.5 ku，理论等电点为9.69；能够清除大多数高毒性且耐药的革兰氏阳性和革兰氏阴性致病菌，杀菌率高达99.99%，在不同温度下均具有较高活性，且在中性和弱碱性环境下杀菌效果更好，但在高盐环境下会失活；对小鼠红细胞无溶血作用；在构建的人工污染香菜模型中能将叶片和洗涤液中的致病菌清除约90.00%，同时能清除食品接触面上99.00%以上的致病菌。结果表明，噬菌肽SEYT4是一种对致病菌有良好的杀菌效果且安全性高的新型抗菌肽，能够有效防控食品链中污染的致病菌，有望成为一种食品加工链中的实用消毒剂。
食品生产、加工等过程中，致病菌在不锈钢、塑料等材料制成的食品加工设备表面可长时间存
在食品工业中，常用的化学消毒剂如含氯化合物、乙醇、有机酸和表面活性剂等，虽然能控制致病菌的污
笔者以课题组前期筛选到的沙门氏菌噬菌体LPSEY
1）菌株。猪链球菌（Streptococcus suis）SC19、P1/7、LSM102、LSM178菌株，粪肠球菌（Enterococcus faecalis）LEFS2菌株，屎肠球菌（Enterococcus faecium）LEFM1、LEFM2菌株，鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）LAB11、LAB12、LAB13菌株，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LPA3、LPA4、LPA6菌株及副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）LVP1、LVP78菌株由笔者所在实验室保存；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）LSA139、LSA140、LSA141、LSA144菌株，粪肠球菌（Enterococcus faecalis）ATCC51299菌株，大肠杆菌（Escherichia coli）LEC32、LEC33菌株及沙门氏菌（Salmonella）ATCC13076、ATCC13311菌株来源于美国菌种保存中心。
所有菌株使用LB液体培养基并于37 ℃进行振荡培养。使用添加1.5% （m/V）琼脂的LA固体培养基进行单菌落筛选和细菌计数。
2）30 mmol/L HEPES（pH=7.4）缓冲液。使用1 mol/L HEPES缓冲液和1 mol/L HEPES sodium salt 缓冲液调整pH至7.4，过滤除菌后用无菌水稀释备用。
噬菌肽SEYT4（RKQNWTEMCNRITDWDMGGKYRGLTIRKQSQSRESQC）采用固相肽技术合成（南京GenScript公司）并使用高效液相色谱法测定肽的纯度为90.60%。将合成的噬菌肽溶于纯水中，制备质量浓度为1 mg/mL的原液，-80 ℃保存备用。使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和HeliQuest服务器（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/）分别预测噬菌肽的各种物理和化学参数。使用I-TASSER在线服务器（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）预测噬菌肽的结构。
分别使用无菌水（水环境）、50%三氟乙醇（TFE，模拟微生物膜的疏水环境）和30 mmol/L SDS胶束（模拟带负电的原核膜的类似环境）制备200 μg/mL的肽溶液以测定在不同条件下肽的状态。将上述肽溶液置于石英比色皿中，使用圆二色谱仪记录其在室温下的波长变化，其中扫描速度为100 nm/min，光谱带宽为0.1 nm，带宽为1 nm，扫描波长范围为190~250 nm，每个波长下扫描3次取平均值，作图后根据扫描出的谱带判断噬菌肽的二级结构。
测定方法如Euler
细菌处理方法同本文“1.4”，在96孔板中加入等体积的菌液（1
细菌处理方法同本文“1.4”，处理后的细菌（1
取1 mL 5周龄C57BL/6雌性小鼠的全血于肝素钠抗凝管中，4 ℃下以3 500 r/min离心10 min，弃上清后使用PBS洗涤2~3次以除去血清和其他杂质，获得100%红细胞。将红细胞用PBS稀释至4%（V/V）并吸取100 μL分装至不同离心管中，加入100 μL不同质量浓度的噬菌肽，分别以PBS和1%（V/V）Triton X-100作为阴性对照和阳性对照，混匀后置于37 ℃孵育1 h，然后将混合物在4 ℃下以3 500 r/min离心10 min，吸取150 μL上清至96孔板，用酶标仪测定在540 nm处的吸光值，试验设置2组平行，重复3次，取平均值。试验组与阴性对照吸光值越接近即表明噬菌肽的溶血活性越低，即噬菌肽安全性越高。
新鲜的香菜（Coriandrum sativum L.）购自华中农业大学农贸市场。使用自来水彻底清洗未受损的香菜叶片，在75%乙醇中浸泡1 min后用无菌水彻底冲洗，再在无菌水中浸泡30 min。将大小相近的叶片在HEPES缓冲液中浸泡10 min后转移至无菌培养皿中晾干。细菌培养方法同本文“1.4”，吸取10 μL细菌（1
使用2 cm×2 cm的无菌塑料板和硅胶片模拟不同材质的厨具。按照本文“1.4”所述处理细菌。随后将100 μL处理后的细菌（1
根据噬菌体LPSEYT的基因组（GenBank： MH181876.1），筛选出含有37个氨基酸的噬菌肽SEYT4。I-TASSER的预测结果显示SEYT4是1个发夹状的双α-螺旋结构（
图1 SEYT4的结构特征
Fig.1 Characterization of SEYT4
A.SEYT4的结构预测 Structural prediction of SEYT4；B.SEYT4的螺旋轮图 Spiral wheel diagram of SEYT4；C. SEYT4在不同环境中的圆二色谱图 Circular dichrograms of SEYT4 in different environments.
如
图2 SEYT4对革兰氏阳性细菌（A）和革兰氏阴性细菌（B）的杀菌作用
Fig.2 Bactericidal effect of SEYT4 against Gram-positive bacteria （A） and Gram-negative bacteria（B）
如
噬菌肽的杀菌动力学结果显示，噬菌肽在2 min内能够将金黄色葡萄球菌减少约99.99%，且在1 h内经噬菌肽处理后的细菌未见增长，杀菌活性依旧良好（
图3 SEYT4对金黄色葡萄球菌（A）和鲍曼不动杆菌（B）的杀菌动力学
Fig.3 Bactericidal kinetics of SEYT4 of Staphylococcus aureus （A） and Acinetobacter baumannii （B）
噬菌肽SEYT4在不同温度（4 ℃、25 ℃和37 ℃）下均具有较高的活性，可将1
图4 SEYT4在不同温度（A、B）、盐浓度 （C、D）及pH （E、F）下对金黄色葡萄球菌（A、C、E）和鲍曼不动杆菌（B、D、F）的杀菌作用
Fig.4 Bactericidal effect of SEYT4 against Staphylococcus aureus （A， C， E）and Acinetobacter baumannii （B， D， F） at different temperatures （A， B）， salt concentrations （C， D） and pH （E， F）
在不同浓度的NaCl溶液中，噬菌肽SEYT4的杀菌活性受到影响。在50 mmol/L NaCl溶液中，噬菌肽SEYT4能够将金黄色葡萄球菌减少约99.99%，能将鲍曼不动杆菌减少约90.00%；但当NaCl溶液浓度超过50 mmol/L时，噬菌肽SEYT4对金黄色葡萄球菌的杀菌活性完全被抑制，对于鲍曼不动杆菌最多可杀灭约60.00%（图
在不同pH下，噬菌肽SEYT4对金黄色葡萄球菌LSA140（
SEYT4的安全性试验结果显示，不同质量浓度的噬菌肽（3.125~100 μg/mL）均不会破坏小鼠红细胞的完整性，表明SEYT4对小鼠是安全的（
图5 SEYT4的溶血活性
Fig. 5 The hemolytic activity of SEYT4
在37 ℃条件下，用质量浓度为500 μg/mL的SEYT4处理香菜叶片1 h后，观察到受污染香菜叶片上的金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的数量减少约80.00%（
图6 SEYT4在香菜叶上（A）和洗涤液中（B）对金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的杀菌作用
Fig. 6 Bactericidal effect of SEYT4 against Staphylococcus aureus and Acinetobacter baumannii on coriander leaves （A） and in washing buffer （B）
在模拟的塑料接触面上，噬菌肽SEYT4最多可清除约99.00%以上的金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌（
图7 SEYT4对塑料接触面（A）和硅胶接触面（B）上金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌的杀菌作用
Fig. 7 Bactericidal effect of SEYT4 against Staphylococcus aureus and Acinetobacter baumannii on plastic contact surfaces （A） and silicone contact surfaces （B）
噬菌肽SEYT4是笔者所在研究室从沙门氏菌噬菌体LPSEYT中筛选出1条活性良好的抗菌
噬菌肽在实际生产应用中使用需考虑其安全性，而通过噬菌肽与真核细胞相互作用可以评判噬菌肽应用于食品中的潜力。本研究中安全性试验结果表明，噬菌肽SEYT4不会损害哺乳动物小鼠红细胞。另外，细胞毒性也是评判多肽类抗菌药物安全性的一个重要指标。已有研究表明抗菌肽CPF-C1 质量浓度达到128 μg/mL时，肽对人胚肾细胞系未显示出细胞毒
金黄色葡萄球菌、不动杆菌和大肠杆菌等常见的致病菌多存在于食品加工各个环节，在食品加工和储存期间的不良卫生状况可能会导致它们进入食物链。在本研究的香菜叶片模型中，SEYT4被证明是一种有效的消毒剂，能够明显清除叶片上细菌的同时也能将洗涤液中约99.00%的细菌清除，大大降低了洗涤过程中交叉污染的风险；在接触面模型中，SEYT4能清除食品接触面上约99.99%的细菌，表明噬菌肽在食品加工链中具有很大的应用潜力。然而与杀菌试验相比，噬菌肽在香菜中的杀菌能力相对降低，推测可能是由于噬菌肽与叶片表面未充分接触或香菜中维生素和醇类等物质的存在导致噬菌肽在香菜叶片上的杀菌能力有所降低。
综上所述，噬菌肽SEYT4可有效控制食品加工链中致病菌的交叉污染，有望成为一种食品加工链中的实用消毒剂。本研究在拓宽抗菌肽来源的同时，也为食品安全领域提供了一种新的防控技术。
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