摘要
为深入研究lpin1基因在鱼类肌肉损伤修复过程中的作用机制，以团头鲂（Megalobrama amblycephala）为研究对象，采用荧光定量PCR和整胚原位杂交技术检测团头鲂lpin1基因的时空表达及肌肉损伤后该基因的表达变化。结果显示，团头鲂lpin1基因的ORF序列长2 694 bp，编码897个氨基酸，编码的蛋白质具有高度保守的Lipin-N、Lipin-mid和LNS2（Lipin/Ned1/Smp2）结构域，系统进化树分析显示团头鲂Lpin1与鲤和斑马鱼的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示，lpin1在团头鲂胚胎发育过程中的各个时期均有表达，且在成鱼肌肉组织中表达量最高；整胚原位杂交进一步显示lpin1在肌肉效应期和心跳期的头部和体节中特异表达；对团头鲂幼鱼肌肉进行不同程度损伤后，与未损伤组相比，lpin1基因分别在轻度损伤后48 h和重度损伤后72 h的表达量最高，pax7基因表达量分别在轻度损伤后144 h和重度损伤后96 h最高。以上结果表明，lpin1基因可能在团头鲂肌肉损伤和修复的过程中扮演着重要角色。
骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell，MuSC）是参与肌肉受损后修复和再生过程的肌肉干细
Lpin1既可以作为一种磷脂酸磷酸化酶（phospha-tidic acid phophyhydrolase，PAP）参与磷脂和甘油三酯的合
前期基于团头鲂骨骼肌损伤后的转录组数据分析发现，lpin1基因在团头鲂肌肉损伤后差异表
本研究使用的团头鲂幼鱼（1龄）全长（15.62±2.33） cm，购自黄冈团头鲂养殖场，充氧袋打包运回华中农业大学水产学院试验基地，并于池中暂养2周后用于肌肉损伤试验。供试鱼用0.1%的MS-222（Sigma）麻醉后，用直径0.2 cm的针头插入其排泄孔上方侧线附近的肌节中进行肌肉损伤操作，其中轻度损伤的长度约为0.3 cm，重度损伤的长度约为1 cm，深度约为0.5 cm。将损伤后的团头鲂鱼体消毒后立即放入清水中，正常养殖。分别于损伤后0、24、48、72、96、144、216 h取损伤部位的肌肉组织（规格为1.0 cm ×1.0 cm），所取样品立即放入液氮中保存，每个时间点取9尾鱼样本。
试验所需胚胎及仔鱼是通过3对团头鲂亲本人工授精而来。受精卵在平均水温27 ℃左右的孵化桶中进行孵化，解剖镜下观察胚胎发育情况，取样后立即放入液氮中保存。原位杂交所用胚胎去卵膜后于4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h后脱水至甲醇中-20 ℃保存。另外，采集团头鲂成鱼（n=3）肝脏、鳃、心脏、大脑、肠道和肌肉等6个组织样品，用于分析目的基因在各组织中的表达情况。
参照TRIzo
从笔者所在实验室前期已有的团头鲂转录组数据中获得lpin1基因的序列，通过PCR验证该基因的ORF序列，并送至武汉天一辉远科技有限公司测序，PCR引物见
| 引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence (5′-3′) | 用途 Application |
|---|---|---|
| lpin1-ORF-F | ATGAACTACGTGGGTCAGTTGGC |
扩增ORF Amplifying ORF |
| lpin1-ORF-R | TTAGCTGCTCTGAGCATGTTGATCC | |
| lpin1-WISH-F | TACGCACTTCAGAGCCATCAC |
合成探针 Synthesizing probes |
| lpin1-WISH-R | TAATACGACTCACTATAGGGGACGCTGAAGACCACATC | |
| lpin1-qRT-F | ACCCTCTCCGGCTGTATTGA |
荧光定量PCR Fluorescent quantitative PCR |
| lpin1-qRT-R | CTGACCGGCTCCCCATTTAT | |
| pax7-qRT-F | GAGGCCTCTTCCGTTAGCTC | |
| pax7-qRT-R | GCTGCGTCTCTGTTTCCTCT | |
| ef-1α-qRT-F | CTTCTCAGGCTGACTGTGC | |
| ef-1α-qRT-R | CCGCTAGCATTACCCTCC |
运用在线网站（www.ncbi.nlm.nih.gox/orffinder）预测氨基酸序列；使用MAGA 6.0软件构建Lpin1蛋白的系统进化树、DNAMAN软件进行Lpin1蛋白的多序列比对；蛋白质信号肽预测、蛋白质的理论分子质量和理论等电点分析分别用软件SignalP（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和Protparam（http：//web.expasy.org/protparam）进行；利用NCBI的CDD数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）预测Lpin1蛋白的结构域。
为分析lpin1基因的时空表达谱，本研究分别以团头鲂成鱼各组织、胚胎发育各时期和不同损伤程度的肌肉的cDNA为模板，以ef-1α作为内参基因，试验步骤参照文献［
团头鲂lpin1基因的ORF序列长度为2 694 bp，编码897个氨基酸。预测的蛋白理论分子质量为98.93 ku，理论等电点为5.43。SignalP预测结果显示，Lpin1蛋白N-末端无信号肽，为非分泌型蛋白。基于多个物种Lpin1氨基酸序列的系统进化分析显示，鱼类聚为1个分支，爬行类、鸟类和哺乳类形成另一分支，在鱼类分支中团头鲂与鲤和斑马鱼的亲缘关系最近（
图1 Lpin1的系统进化分析
Fig.1 Phylogenetic analysis of Lpin1
带三角形的为团头鲂Lpin1蛋白，节点上的数值表示bootstrap。Lpin1 protein of M. amblycephala was shown in black triangles， value on the nodes represent the bootstrap.
图2 Lpin1蛋白的氨基酸序列多重比对
Fig. 2 Multiple alignment and analysis of amino acid sequences of Lpin1 proteins
Lipin-N、Lipin-mid和LNS2分别为3个保守的结构域。Three conserved domains， Lipin-N， Lipin-mid and LNS2 were found.
使用荧光定量PCR分析lpin1基因在团头鲂成鱼各组织和胚胎各发育阶段的表达，结果发现lpin1 mRNA在肌肉和心脏中的表达量最高且显著高于其他组织（
图 3 lpin1基因在团头鲂成鱼各组织中的相对表达量
Fig.3 The relative expression of lpin1 in adult M. amblycephala tissues
柱上不同字母表示差异显著，P<0.05。下同。Different letters indicated significant difference （P<0.05）.The same as below.
图4 lpin1基因在团头鲂胚胎各发育阶段的相对表达量
Fig.4 Relative expression of lpin1 at M. amblycephala different embryo development stages
Fe：受精卵时期；2：2-细胞期；Bl：囊胚期；Ga：原肠胚期；Ne：神经胚期；Ap：体节期；M：肌肉效应期；Ha：出膜期；dph：出膜后天数。Fe： Fertilized eggs； 2： 2-cell stage； Bl： Blastula stage； Ga： Gastrula stage； Ne： Neurula stage； Ap： Appearance of myomere stage； M： Muscle functioning stage； Ha： Hatching stage； dph： Days post hatching.
图5 原位杂交技术检测团头鲂lpin1基因在胚胎不同发育时期的表达
Fig.5 Expression of lpin1 gene at different embryo development stages of M. amblycephala based on in situ hybridization
图中蓝色为杂交信号，标尺：200 μm。Blue for hybridization signals of lpin1 gene. Scale bars： 200 µm.
荧光定量PCR结果显示，与未损伤组相比，lpin1和pax7基因在轻度和重度损伤后24 h的表达均下调。轻度损伤后，lpin1表达量在48 h达到峰值，然后降低，但在48~216 h其表达量均高于对照组；而pax7基因表达量在损伤后96 h显著升高，并在144 h达到最高。重度损伤后，lpin1表达量在72 h和216 h时显著高于对照组；pax7表达量在48 h和96~216 h均显著高于对照组，且在96 h达到峰值（
图6 团头鲂lpin1（A）和pax7（B）基因在肌肉损伤修复过程中的表达变化
Fig.6 Expression changes of lpin1 （A）and pax7（B） genes during muscle repair of M. amblycephala
不同小写（大写）字母表示不同时间轻度（重度）损伤之间有显著性差异，P<0.05。Different lowercase letters（uppercase letters） indicated significant difference between mild injuries （severe injuries） at different times， P<0.05.
本研究获得了团头鲂lpin1基因ORF全长2 694 bp，编码897个氨基酸。通过对不同物种功能结构域分析发现，该蛋白的氨基末端和羧基末端都有一段高度保守的序列，分别为Lipin-N和LNS2（Lipin/Ned1/Smp2）结构域。其中LNS2结构域包含了磷脂酸磷酸酶活性序列DxDxT和转录共激活因子功能的活性位点基序LxxIL，DxDxT的存在将Lpin1鉴定
为卤代酸脱卤酶超家族（haloacid dehalogenase superfamily， HAD）的成
本研究发现lpin1 mRNA在团头鲂成鱼肌肉和心脏中的表达显著高于其他组织。类似地，在小鼠中，lpin1基因在脂肪、心脏和骨骼肌中高表
当骨骼肌出现损伤后，肌卫星细胞被激活，通过增殖、迁移和分化形成肌细胞，经过融合过程后形成新的肌纤维以修复受伤的肌肉组
综上，本研究克隆获得团头鲂lpin1基因，其Lipin-N、Lipin-mid和LNS2结构域在进化上高度保守。时空表达结果显示lpin1在团头鲂成鱼肌肉中的表达量最高，从受精卵到出膜后20 d的各个时期均有表达，且肌肉效应期和心跳期时在头部和体节中特异表达。另外，本研究也发现团头鲂肌肉不同程度损伤后，lpin1与pax7基因表达变化呈现相似趋势，这些结果可为研究lpin1基因在鱼类肌肉损伤和修复过程中的分子机制奠定基础。
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