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Wnt/β-catenin/VEGF通路在副猪嗜血杆菌引起猪内皮细胞损伤中的作用  PDF

  • 滑坷鑫 1 ✉
  • 彭宇娜 1
  • 孙煜 1
  • 张俐文 1
  • 张四化 2
  • 万云 2
  • 金卉 1 ✉
1. 华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院，武汉430070； 2. 武汉市动物疫病预防控制中心，武汉 430016

中图分类号： S852.61

最近更新：2024-11-22

DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2024.05.021

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EN 引
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摘要

为探究副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起猪渗出性炎症的过程中血管内皮屏障的变化情况，以HPS感染原代猪血管内皮细胞，通过Western blot和荧光定量PCR检测HPS对Wnt/β-catenin通路及其下游靶基因表达的影响，并通过间接免疫荧光和跨内皮电阻测定检测细胞间黏附连接结构的改变。结果显示：HPS感染激活猪内皮细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，促使胞质中的β-catenin蛋白发生核转位，导致胞膜处由β-catenin和血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）构成的黏附连接结构被破坏，细胞通透性增加。抑制Wnt/β-catenin通路下游血管内皮生长因子（VEGF）基因的表达，可以明显抑制β-catenin的核转位，显著恢复内皮细胞间β-catenin和VE-cadherin构成的黏附连接结构，恢复内皮细胞通透性。以上研究结果表明，HPS通过激活猪内皮细胞中Wnt/β-catenin通路，破坏细胞间黏附连接，增加内皮细胞通透性；同时，Wnt/β-catenin通路下游VEGF基因通过正反馈调节效应放大了HPS感染引起的Wnt/β-catenin信号通路的激活效应和细胞结构的损伤。

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis， HPS）早期定殖于猪上呼吸道，在猪处于应激、免疫力低下等情况时侵入动物机体，引起以全身性的渗出性纤维素炎为特征的猪格拉泽氏病（Glässer’s disease），严重时死亡率可达 50%［

1-2］。然而，目前对于HPS引起渗出性纤维素炎的病理机制缺乏充分研究。渗出性炎症的发生表明在HPS感染过程中，血管内皮通透性增加。在针对出血性休克疾病的研究中发现，微血管通透性过高主要由于内皮细胞间黏附连接（adherens junctions，AJs）结构受到破坏［3］，内皮细胞间AJs由血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial-cadherin，VE-cadherin）通过其胞外结构域与相邻内皮细胞的VE-cadherin 形成同型性黏附，同时通过胞内结构域与 β-catenin连接，VE-cadherin/β-catenin复合物共同锚定在构成细胞骨架的肌动蛋白上［4］。β-catenin除了作为构成AJs的结构蛋白，同时也是经典Wnt/β-catenin信号通路中的核心信号转导蛋白［5］。Wnt/β-catenin通路被激活后，β-catenin通过转位入核发挥转录调控作用，调节通路下游纤溶酶原激活抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、胶原蛋白Ⅲ（collagen Ⅲ）、纤连蛋白（fibronectin）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等与细胞黏附及迁移相关基因的表达，影响细胞通透性和移动性［6-7］。

Wnt/β-catenin 信号通路的下游靶基因VEGF通过与其受体VEGFR结合，阻断细胞连接中信号的传递，增强血管渗漏。VEGF加强血管通透性的作用强于组织胺约50 000倍［

8］。细胞超微结构研究显示，VEGF处理后的血管内皮细胞间出现大量裂隙及血管基底膜的退行性病变。临床血管渗漏相关研究表明，VEGF可以在15 min内切断内皮细胞中VE-cadherin/β-catenin复合体间的连接，引起内皮通透性增高［9-10］。

本研究解析HPS感染过程中Wnt/β-catenin 信号通路对内皮细胞间黏附连接结构变化的调节作用，分析Wnt/β-catenin 信号通路对内皮细胞通透性的影响。初步探究HPS引起渗出性纤维素炎的分子机制，旨在为疫苗设计和药物靶标选择奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与菌株

猪血管内皮细胞（porcine aortic endothelial cell，PAEC）为原代分离细胞，根据Beijnum等［

11］的方法从30日龄的仔猪主动脉中分离。PAEC使用添加10%胎牛血清且不含抗生素的M199培养基于37 ℃、5% CO2条件下进行细胞培养。副猪嗜血杆菌SH0165株为笔者所在研究室保存，在TSA培养基中复苏，挑取单菌落到含5%牛血清和1%NAD的TSB培养基中200 r/min振荡培养过夜至OD600 nm=0.6。菌液收集至离心管中，12 000 r/min离心10 min，PBS洗涤3次后用于感染细胞。

1.2 Western blot检测

待细胞长至80%融合时进行siRNA转染或HPS感染。高毒力HPS菌株HPS-SH0165（108 CFU/mL）感染相应时间后收样。siRNA转染24 h后继续用HPS感染12 h后收样。阴性对照组（CON）或siRNA对照组（NC）加入等体积PBS处理。LiCl（20 mmol/L）作为Wnt/β-catenin通路激活的阳性对照。IWR-1-endo（10 μmol/L）处理作为抑制Wnt/β-catenin通路激活的对照。PBS洗涤细胞3次，每孔加入200 μL裂解液裂解细胞。收集细胞裂解液与2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水浴10 min，12 000 r/min离心10 min后取上清上样。细胞膜质核蛋白分离样品根据试剂盒说明书制备。将SDS-PAGE胶中的蛋白质转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后放入根据说明书稀释的一抗和二抗溶液中分别孵育2 h和1 h。洗涤3次后经成像仪显影。LiCl购自Sigma公司。β-catenin 抗体为SantaCruz公司产品。磷酸化β-catenin抗体购自Cell Signaling Technology公司。β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自碧云天生物技术研究所。

1.3 实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测基因mRNA水平

根据说明书使用Omega公司的细胞RNA提取试剂盒及反转录试剂盒提取细胞总RNA并反转录成cDNA，按照SYBR Green Real-time PCR Mix说明书检测细胞中待测基因mRNA水平，程序为：94 ℃预扩增10 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。mRNA相对表达水平的定量采用比较Ct法来计算相对定量，基因的相对mRNA表达水平通过GAPDH来标准化。荧光定量检测引物序列见表1。

表1  本研究所用的荧光定量引物序列
Table 1  The sequences of primers used in this study for qRT-PCR
基因 Gene正向引物（5'-3'） Forward (5' to 3')反向引物（5'-3'） Reverse (5' to 3')
VE-cadherin ACCACGAGATGTGAAGTTCAA GTGATGTTGGCCGTGTTATCG
Collagen Ⅲ GCATTCCTTCGACTTCTCTCTAG TTCCATGTACGCAATGCTATT
Fibronectin GAACCAGCAACCGAGTACACAA CCCGATCAGAGGCTCACTCT
VEGF GCTCTCTTGGGTGCATTGGA GCAGCCTGGGACCACTTG
PAI-1 TGCCGCCCCCTACGA TGAGCTGAGCGTCCAGAATG
GAPDH CCCCAACGTGTCGGTTGT CCTGCTTCACCACCTTCTTGA

1.4 间接免疫荧光试验

接种PAEC于细胞爬片上，培养至50%~60%融合后进行siRNA转染、抑制剂预处理或直接进行细菌感染。各组细胞处理方法本文“1.2”所述。HPS（108 CFU/mL）感染12 h后依次使用4%多聚甲醛和0.5% TritonX-100于室温进行固定和通透。5% BSA封闭1 h后依次使用一抗和荧光二抗各孵育1 h。经DAPI染色15 min后用50%甘油封片，使用激光共聚焦显微镜观察。Alexa Fluor标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG购自碧云天生物技术研究所。

1.5 跨内皮电阻测定

在Transwell培养系统的上层小室中接种PAEC细胞，按照说明书使用EVOM2仪器连续监测其TEER值直至数值稳定，接种HPS（108 CFU/mL）感染后连续监测上层小室细胞的TEER值，记录数值。

1.6 小干扰RNA（siRNA）转染

细胞培养至80%融合后，按脂质体转染试剂盒说明书对各组细胞分别进行siRNA转染，每孔细胞转染40 pmol的siRNA。转染24 h后进行HPS（108 CFU/mL）感染。各组细胞处理方法本文“1.2”所述。各干扰因子和阴性对照（negative control，NC）siRNA由上海吉玛公司设计合成（序列见表2），根据说明书要求配制。

表2  本研究中所用的干扰因子序列
Table 2  The sequences of siRNA used in this study

基因

Gene

正向序列（5'-3'）

Sense sequence (5' to 3')

反向序列（5'-3'）

Anti-sense sequence (5' to 3')

siVEGF-1 GCAGAUUAUGCGGAUCAAATT UUUGAUCCGCAUAAUCUGCTT
siVEGF-2 GCGGAGAAAGCAUUUGUUUTT AAACAAAUGCUUUCUCCGCTT
siVEGF-3 GCGAGGCAGCUUGAGUUAATT UUAACUCAAGCUGCCUCGCTT
Negative control UUCUCCGAACGUGUCACGUTT ACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.7 统计学分析

所有试验进行3次独立重复检测，数据以平均值±标准误差（SEM）表示。使用单向方差（ANOVA）进行统计学显著性分析。*表示其统计值存在显著差异，P<0.05；**表示其统计值存在极显著差异P<0.01。统计分析使用软件Prism 8（GraphPad）。

2 结果与分析

2.1 HPS感染PAEC对Wnt/β-catenin信号通路活性及其下游靶基因表达的影响

Western blot检测结果显示，HPS-SH0165感染后PAEC中β-catenin的蛋白水平呈时间依赖性增高，磷酸化β-catenin（p-β-catenin）水平显著降低，表明HPS感染的PAEC中Wnt/β-catenin通路被激活（图1A）。荧光定量PCR检测结果显示，HPS-SH0165感染PAEC后，Wnt/β-catenin通路下游维持细胞与基底的黏附力的纤连蛋白（fibronectin）和胶原蛋白Ⅲ（collagen Ⅲ）基因表达量下降，促进细胞迁移的纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）基因和和促进内皮细胞渗漏的血管内皮生长因子（VEGF）基因表达量明显上调，表明HPS感染激活PAEC中的Wnt/β-catenin通路促使内皮细胞黏附性降低、移动性增加，使得内皮细胞构成的屏障稳定性被破坏（图1B）。

图1  HPS感染的PAEC中Wnt/β-catenin通路活性（A）及下游靶基因表达水平（B）变化

Fig.1  Changes in Wnt/β-catenin pathway activity （A） and expression levels of downstream target genes （B） in HPS-infected PAEC

2.2 HPS对PAEC中β-catenin蛋白核转位效应的影响

分离提取PAEC不同细胞结构中的蛋白质，经过Western blot检测发现，HPS-SH0165刺激PAEC后，胞膜上的β-catenin含量减少，而胞质和胞核中β- catenin蛋白水平显著增加（图2A）。间接免疫荧光试验的结果同样显示，HPS-SH0165刺激PAEC后，胞膜上的β-catenin含量减少，β-catenin聚集于胞质并大量转位入核（图2B）。该结果进一步证明HPS对PAEC中Wnt/β-catenin通路的激活效应。

图2  Western blot （A）和间接免疫荧光（B）检测HPS感染的PAEC中β-catenin的核转位效应

Fig.2  Western blot （A） and indirect immunofluorescence （B） detection of nuclear translocation of β-catenin in HPS-infected PAEC

2.3 Wnt/β-catenin通路对HPS感染的PAEC中黏附连接结构及细胞通透性的影响

间接免疫荧光检测结果显示，HPS感染的PAEC细胞中β-catenin转位入核，VE-cadherin表达水皮降低，胞膜处构成细胞间黏附连接结构的β-catenin/VE-cadherin复合物减少。在使用Wnt/β-catenin通路特异性抑制剂IWR-1-endo处理后，HPS感染的PAEC中β-catenin的核转位效应减弱，VE-cadherin表达水平升高，β-catenin/VE-cadherin复合物含量明显恢复（图3A）。Transwell检测结果显示，HPS刺激后，PAEC形成的单层细胞屏障通透性增强，在用Wnt/β-catenin通路特异性抑制剂IWR-1-endo处理后通透性明显恢复（图3B）。以上结果表明，Wnt/β-catenin通路介导了对HPS感染时内皮细胞间黏附连接结构的调控，从而影响血管内皮细胞通透性。

图3  HPS感染的PAEC中黏附连接结构（A）及细胞通透性（B）的变化

Fig.3  Changes in the structure of adherens junctions （A） and cell permeability （B） of HPS-infected PAEC

2.4 VEGF对HPS感染的PAEC中VE-caherin表达水平的影响

荧光定量检测结果显示，HPS感染可以引起VEGF基因的显著上调，在抑制Wnt/β-catenin通路活性后，VEGF的表达量明显下降，表明Wnt/β-catenin通路调控HPS感染引起的PAEC中VEGF基因的表达（图4A）。筛选特异性沉默猪VEGF基因的siRNA抑制PAEC中VEGF基因的表达（图4B），荧光定量（图4C）及Western blot（图4 D）检测发现，抑制VEGF表达可以显著恢复HPS感染的PAEC中VE-cadherin的表达水平。以上结果表明，HPS通过激活Wnt/β-catenin通路上调VEGF表达，促使PAEC中VE-cadherin的表达水平降低。

图4  HPS感染的PAEC中VEGF对Wnt/β-catenin通路活性的调控作用

Fig.4  Regulatory effect of VEGF on the activity of Wnt/β-catenin pathway in PAECs infected with HPS

A：加入Wnt/β-catenin通路抑制剂后VEGF表达水平的变化；B：siRNA对VEGF表达水平的干扰；C，D：荧光定量PCR（C）和Western blot （D）检测抑制VEGF表达后VE-cadherin表达水平。A： Changes of VEGF expression level after addition of Wnt/β-catenin pathway inhibitors； B： Interference of VEGF expression levels by siRNA； C， D： The expression level of VE-cadherin was detected by fluorescence quantitative PCR （C） and Western blot （D）.

2.5 VEGF对HPS感染的PAEC中黏附连接结构的影响

间接免疫荧光检测结果显示，抑制VEGF可以明显恢复HPS感染的PAEC胞膜处VE-cadherin的蛋白水平，同时显著减少β-catenin的核转位，增加胞膜处β-catenin/VE-cadherin复合物含量，恢复内皮细胞间黏附连接结构（图5A）。表明VEGF对Wnt/β-catenin通路激活引起的β-catenin核转位存在放大反馈调节作用，同时HPS上调VEGF可以显著抑制PAEC中VE-cadherin的表达。Transwell试验结果显示抑制VEGF的表达可以明显降低HPS感染时单层PAEC的通透性（图5B）。以上结果表明，HPS感染的PAEC中，VEGF可以通过对Wnt/β-catenin通路的放大反馈调节作用进一步破坏内皮细胞间黏附连接结构及内皮屏障的完整性。

图5  干扰VEGF对HPS感染的PAEC中VEGF介导的黏附连接结构（A）及细胞通透性（B）的调控作用

Fig.5  Regulation of VEGF-mediated adhesion structure （A） and cell permeability （B） in PAEC with interference of VEGF in HPS infection

3 讨论

前期研究表明，在HPS感染过程中，猪肺泡巨噬细胞分泌的抵抗素（resistin）可以破坏血管内皮细胞间由Claudin-5和Occludin蛋白构成的紧密连接结构（tight junctions）［

12］。但在该研究中发现，抵抗素对内皮细胞中负责构成黏附连接的VE-cadherin表达水平没有明显影响。本研究结果显示，HPS可以通过Wnt/β-catenin通路直接调控PAEC中VE-cadherin的表达，而不依赖于抵抗素的调节作用。

在HPS感染过程中，Wnt/β-catenin信号通路的作用存在一定的复杂性。在以上皮细胞作为HPS感染模型的研究中发现，HPS激活Wnt/β-catenin信号通路后，可以抑制上皮细胞中E-cadherin的表达，同时促进间质细胞标志性基因N-cadherin的表达，促使上皮细胞表型向间质细胞转变，即发生上皮-间质转换效应（epithelial-mesenchymal transition， EMT），从而破坏上皮细胞屏障的稳定性，促进细菌向宿主全身的扩散［

13-14］。在此过程中，Wnt/β-catenin通路通过调控下游TCF/LEF 转录因子（如Snail和Slug）与E-cadherin基因启动子区域结合，直接调控细胞中E-cadherin的表达［15-16］。然而，目前尚未有研究证明Wnt/β-catenin通路可以直接调控VE-cadherin的表达，本研究的结果显示，在HPS感染过程中，Wnt/β- catenin通路通过上调VEGF表达，降低PAEC中VE-cadherin的表达水平，抑制VE-cadherin在细胞间形成黏附连接。有研究表明，VEGF对VE-cadherin的调控在血管重塑与生成、人类卵巢癌的病理性腹水形成等生理和病理过程中都具有重要作用［17-18］，这与本研究的结果相符。

综上所述，本研究证明Wnt/β-catenin通路介导HPS感染的猪内皮细胞中黏附连接结构的断裂，促使内皮细胞结构受损、细胞通透性增加。同时，HPS感染上调Wnt/β-catenin通路下游靶基因VEGF的表达，VEGF通过正反馈调节放大HPS感染引起的Wnt/β-catenin通路的激活效应，并抑制PAEC中VE-cadherin的表达。本研究解析了HPS感染过程中Wnt/β-catenin通路对内皮细胞结构完整性的调节作用，明确了VEGF在HPS引起内皮屏障损伤的过程中所发挥的正反馈放大效应。

参考文献References

1

OLIVEIR S，PIJOAN C.Haemophilus parasuis： new trends on diagnosis，epidemiology and control ［J］.Veterinary microbiology，2004，99（1）： 1-12. [百度学术] 

2

李继强．副猪嗜血杆菌病的诊断和防治［J］．中国畜牧业，2022（6）：114-115．LI J Q.Diagnosis，prevention and treatment of Haemophilus parasuis disease ［J］.China animal industry，2022（6）： 114-115（in Chinese）. [百度学术] 

3

THARAKAN B，HELLMAN J，SAWANT D，et al.β- catenin dynamics in the regulation of microvascular endothelial cell hyperpermeability ［J］.Shock，2012，37（3）： 306-311. [百度学术] 

4

BALUK P，MCDONALD D.Buttons and zippers： endothelial junctions in lymphatic vessels ［J/OL］.Cold spring harbor perspectives in medicine，2022，12（2）：a041178［2023-05-08］.https：//doi.org/10.1101/cshperspect.a041178. [百度学术] 

5

AKHMETSHINA A，PALUMBO K，DEES C，et al.Activation of canonical Wnt signalling is required for TGF-β-mediated fibrosis ［J/OL］.Nature communication，2012，3：735［2023-05-08］.https：//doi.org/10.1038/ncomms1734. [百度学术] 

6

MATSUZAKI S，DARCHA C.Involvement of the Wnt/β- catenin signaling pathway in the cellular and molecular mechanisms of fibrosis in endometriosis ［J/OL］.PLoS One，2013，8： e76808 ［2023-05-08］.https：//doi.org/10.1371/journal.pone. 0076808. [百度学术] 

7

ZHOU D，TAN R，ZHOU L，et al.Kidney tubular β-catenin signaling controls interstitial fibroblast fate via epithelial-mesenchymal communication ［J/OL］.Scientific reports，2013，3： 1878［2023-05-08］.https：//doi.org/10.1038/srep01878. [百度学术] 

8

SIMUNOVIC F，FINKENZELLER G．Vascularization strategies in bone tissue engineering［J/OL］．Cells，2021，10（7）：1749［2023-05-08］．https：//doi.org/10.3390/cells10071749. [百度学术] 

9

WALLEZ Y，HUBER P.2008.Endothelial adherens and tight junctions in vascular homeostasis，inflammation and angiogenesis ［J］.Biochimica et biophysica acta （BBA）-biomembranes，2008，1778（3）：794-809. [百度学术] 

10

BATES D.Vascular endothelial growth factors and vascular permeability ［J］.Cardiovascular research，2010，87（2）：262-271. [百度学术] 

11

BEIJNUM J，ROUSCH M，CASTERMANS K，et al.Isolation of endothelial cells from fresh tissues ［J］.Nature protocol，2008，3（6）：1085-1091. [百度学术] 

12

HUA K，LI T，HE Y，et al.Resistin secreted by porcine alveolar macrophages leads to endothelial cell dysfunction during Haemophilus parasuis infection ［J/OL］.Virulence，2023，2171636［2023-05-08］.https：//doi.org/10.1080/21505594.2023.2171636. [百度学术] 

13

滑坷鑫．抵抗素和p38 MAPK/Wnt信号通路介导副猪嗜血杆菌感染引起细胞损伤的机制研究［D］．武汉：华中农业大学，2021．HUA K X.Mechanisms of resistin- and p38 MAPK/Wnt pathway-mediated cell damage caused by Haemophilus parasuis［D］.Wuhan：Huazhong Agricultural University，2021（in Chinese with English abstract）. [百度学术] 

14

LOH C Y，CHAI J Y，TANG T F，et al．The E-cadherin and N-cadherin switch in epithelial-to-mesenchymal transition：signaling，therapeutic implications，and challenges［J/OL］．Cells，2019，8（10）：1118［2023-05-08］． https：//doi.org/10.3390/cells8101118. [百度学术] 

15

ONDER T ，GUPTA P，MANI S，et al.Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways ［J］.Cancer research，2008，68（10）： 3645-3654. [百度学术] 

16

NELSON W， NUSSE R. Convergence of Wnt， ß-catenin， and cadherin pathways ［J］. Science， 2004， 303（5663）： 1483-1487. [百度学术] 

17

CAO J，EHLING M，SEEBACH J，et al.Polarized actin and VE-cadherin dynamics regulate junctional remodelling and cell migration during sprouting angiogenesis ［J/OL］.Nature communications，2017，8（1）： 2210［2023-05-08］.https：//doi.org/10.1038/s41467-017-02373-8. [百度学术] 

18

BEKES I， FRIEDL T， KOHLER T， et al. Does VEGF facilitate local tumor growth and spread into the abdominal cavity by suppressing endothelial cell adhesion， thus increasing vascular peritoneal permeability followed by ascites production in ovarian cancer？［J］. Molecular cancer， 2016， 15： 1-13. [百度学术] 

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