摘要
为获得安全性良好、免疫原性高的变异株弱毒苗，采用鸡胚成纤维细胞（CEF）传代培养的方法对猪伪狂犬病病毒流行毒株JS18株进行传代，最终获得JS18-150株，随后通过PCR鉴定、测序、致病力试验和免疫效力试验对JS18-150株的体外生长特性、安全性和免疫原性进行初步研究。试验结果显示，在CEF上连续传代后，JS18株的gI、gE、US9基因缺失，获得的JS18-150株毒力已致弱，在CEF上适应性显著提高，与JS18株生长动力学相似；将JS18-150株以1
猪伪狂犬病（pseudorabies， PR）是一种急性传染病，以体温升高、精神萎靡、食欲不振等为主要特
为了彻底净化伪狂犬病，世界各国都开始进行伪狂犬病疫苗的研发。目前已研制出基因缺失疫苗、弱毒疫苗、重组伪狂犬病毒载体疫苗、亚单位疫
20世纪70年代，伪狂犬病活疫苗Bartha-K61株从匈牙利引入我国，用于猪伪狂犬病的防控，并得到很好的控制。但自2011年以来，使用Bartha-K61株疫苗免疫过的猪场再次暴发猪伪狂犬病，表现为母猪流产、死胎，仔猪高死亡率，通过分离毒株确认其与经典毒株不同，说明伪狂犬病病毒在我国已发生变
猪伪狂犬病病毒JS株由武汉科前生物股份有限公司在江西某猪场病料分离、鉴定、保管和供应；鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts， CEF），由SPF鸡胚制备而成，SPF鸡胚购自济南赛斯；猪睾丸细胞（ST细胞）购自美国标准菌种收藏中心；DMEM、2×DMEM培养基购自Gibco；低熔点琼脂糖购自bioshap；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）购自金源康；猪伪狂犬病病毒gB（PRV gB）抗体ELISA检测试剂盒购自BioCheck；猪伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒购自IDEXX；21日龄伪狂犬病阴性仔猪购自湖北三湖畜牧有限公司。
选取15头猪伪狂犬病阴性的21日龄仔猪（gB-ELISA抗体和gE-ELISA抗体均为阴性），随机分为3组，隔离饲养。JS18株感染组试验猪每头颈部肌肉接种10头份JS18株（1
选取9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉球脱碘，同时在平皿中加入适量Hank’s液，用镊子在气室中间破壳，去气室蛋壳、气室膜，从胎儿眼睛位置下镊子，轻夹颈部挑出胎儿，快速放入平皿中。将鸡胚去头、四肢和内脏，把胚体转入烧杯中，以挑剪方式把胚体剪至小米粒大小后，转移至适宜大小的锥形瓶中，Hank’s液清洗3次。加入0.25%胰酶后快速加盖转入37 ℃水浴锅中消化，将胰酶轻轻倒出，清洗组织3次，加入含10%血清乳汉液，吹打组织、静置、过滤，反复吹打7轮直至仅剩骨头渣。悬液过滤后加入细胞瓶，贴壁过夜，得到鸡胚成纤维细胞。
取猪伪狂犬病病毒JS18株0.1 mL接种CEF细胞中，置37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中继续培养，当细胞病变达到90%以上时，收获上清液和细胞混合物得到JS18-2株。按上述方法将猪伪狂犬病病毒JS18株在CEF细胞上连续传代至100代。从第100代连续5代挑取单个蚀斑，继续传代至第150代得JS18-150株。注意观察细胞病变出现的时间、病变率以及细胞病变的形态变化。
以GenBank中PRV全基因组序列（KP257591.1）作为参考，设计并合成gD/US2基因鉴定引物（
引物 Primer | 序列（5′-3′） Sequence(5′-3′) | 大小/bp Size | |
|---|---|---|---|
| JS18 | JS18-150 | ||
| gD/US2-F | GTCGAGACCGAGACCACCAACACCACCACCACCCAGACGGGCCTGT | 5 837 | 2 629 |
| gD/US2-R | TCACGATCTGGGCATGCAGGGCCTCCGTCCACTCGCCGGCGTGGCGCCA | ||
取猪伪狂犬病病毒JS18株和JS18-150株分别以0.01 MOI接种于单层CEF细胞，分别在接种后12、24、36、48、60、72 h取样，测定各时间点的TCID50。
将JS18株和JS18-150株分别经颈部肌肉接种伪狂犬病阴性猪各5头，1.0 mL/头，病毒含量为1.0×1
选取20头伪狂犬病阴性的21日龄仔猪（gB-ELISA抗体和gE-ELISA抗体均为阴性），随机分4组，隔离饲养。A、C组肌注1头份JS18-150株（1
将猪伪狂犬病病毒JS株接种到CEF细胞，置37 ℃含5%CO2的细胞培养箱中培养3～5 d。每日观察细胞病变，待细胞病变达80%收取细胞上清。将所得病毒株命名为猪伪狂犬病病毒JS18株（
图1 猪伪狂犬病病毒JS18株在CEF上的病变结果
Fig. 1 CPE caused by PRV JS18 in CEF
A：JS18株；B：细胞对照。A： JS18； B： CEF cultured as control.
分离得到的野毒株JS18株在CEF细胞上传代至150代，获得高代次毒株JS18-150株。JS18-150株在体外传代适应性明显提升，表现为相同接种剂量下，JS18-150株感染细胞后形成病变时间缩短，细胞病变面积增大，且单位面积内噬斑数明显多于JS18株（
图2 JS18株和JS18-150株在CEF上的噬斑结果
Fig. 2 Plaque morphology of PRV JS18 and JS18-150 in CEF
A： JS18. B： JS18-150.
分别以猪伪狂犬病病毒JS18株第1代、第50代、第100代、第130代和第150代病毒基因组为模板，以gD/US2引物进行扩增。PCR结果第1代和第50代毒株扩增产物大小为5 837 bp，第100代后扩增产物大小为2 629 bp。测序结果显示第50代与第1代同源性为100%，ORF大小均为5 837 bp。第100代、第130代和第150代该毒株均缺失3 208 bp碱基（从gI基因第269位核苷酸至US9基因，包括gI部分基因、gE全部基因和US9全部基因）；同时gD基因第906位碱基发生点突变。结果表明，gI/US2基因缺失部位稳定，未发生恢复。
将猪伪狂犬病病毒JS18株和JS18-150株分别以0.01 MOI接种单层CEF细胞，接毒后不同时间点收集，反复冻融3次后，对各时间点收集的样品进行毒价测定。结果显示：在CEF细胞上PRV JS18株和JS18-150株的生长趋势基本相同，感染36 h后，病毒滴度均达到顶峰，随后缓慢下降（
图3 猪伪狂犬病病毒JS18株和JS18-150株的生长曲线
Fig. 3 Growth curves of PRV JS18 and JS18-150
将JS18株和JS18-150株接种仔猪后，JS18株感染组5/5仔猪出现精神不振、呼吸困难和食欲减退等临床症状，同时仔猪全部死亡（
图4 仔猪接种不同代次猪伪狂犬病病毒后的存活率
Fig.4 Survival rates of piglets infected with different passages of PRV
空白对照组gB和gE抗体均为阴性（
分组 Groups | 编号 No. | gB抗体（S/P值） gB-specific antibody(S/P value) | gE抗体（S/N值） gE-specific antibody(S/N value) |
|---|---|---|---|
| JS18 | 01 | 1.98 | 0.21 |
| 02 | 1.74 | 0.09 | |
| 03 | 1.68 | 0.15 | |
| 04 | 1.59 | 0.17 | |
| 05 | 1.88 | 0.20 | |
| JS18-150 | 06 | 1.96 | 0.97 |
| 07 | 1.57 | 0.86 | |
| 08 | 1.85 | 1.15 | |
| 09 | 1.69 | 0.90 | |
| 10 | 2.06 | 1.01 | |
|
空白对照组 The control group | 11 | 0.36 | 0.89 |
| 12 | 0.43 | 1.07 | |
| 13 | 0.29 | 0.96 | |
| 14 | 0.39 | 0.82 | |
| 15 | 0.40 | 0.93 |
注： S/P≥0.500，样品gB抗体为阳性；S/P≤0.499，样品gB抗体为阴性；S/N≤0.60，样品gE抗体为阳性，S/N>0.7，样品gE抗体为阴性。Note： If S/P is≥0.500， the sample is positive for gB antibodies； if S/P is≤0.499， the sample is negative for gB antibodies； if S/N is≤0.60， the sample is positive for gE antibodies；if S/N is >0.7， the sample is negative for gE antibodies.
分组 Groups | 接种剂量 Immunizing doses | 临床症状+ Clinical symptoms | 体温（≥40.5 ℃） Temperature | g | g |
|---|---|---|---|---|---|
| JS18 |
1 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 |
| JS18-150 | 0/5 | 0/5 | 5/5 | 0/5 | |
|
空白对照组 The control group | 0 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
注： 临床症状+：精神不振、呼吸困难和食欲减退等。X/Y：发病数/总数（或阳性数/总数）。下同。Note：Clinical symptoms+： depression， respiratory distress and anorexia. X/Y：Number of cases/total（or number of positives/total）.The same as below.
A、C组免疫接种后试验猪精神、食欲正常，接种部位无异常；免疫后28 d免疫组仔猪产生较高的gB抗体水平，PRV中和抗体效价分别为（63.8±5.08）和（54.6±6.65）（图
图5 JS18-150株对仔猪的免疫保护效果
Fig. 5 Protective efficacy of JS18-150 immunization
a：PRV gB特异性抗体水平；b：中和抗体水平. A：免疫组-JS18毒株；B：未免疫组-JS18毒株；C：免疫组-HBZL05毒株；D：未免疫组-HBZL05毒株。下同。a：The level of PRV gB-specific antibody. b：Neutralizing antibody titer. A：Inoculation with JS18-150 and challenged with JS18；B：Inoculation with DMEM and challenged with JS18； C：Inoculation with JS18-150 and challenged with HBZL05； D： Inoculation with DMEM and challenged with HBZL05.The same as below.
分组 Groups | 攻毒毒株 Viral strain | 临床症状+ Clinical symptoms | 体温（≥40.5 ℃） Temperature | 发病 Morbidity | 死亡 Death |
|---|---|---|---|---|---|
| A | JS18 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
| B | JS18 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 |
| C | HBZL05 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
| D | HBZL05 | 5/5 | 5/5 | 5/5 | 5/5 |
解剖结果发现，B、D组仔猪攻毒后，猪只脑出血，扁桃体化脓、出血，而A、C组猪只则无典型病变出现（
图6 攻毒后脑组织的剖检与镜检结果（400×）
Fig.6 Autopsy and microscopic examination of brain tissue after challenge（400×）
→：淋巴细胞浸润；☆：血管“袖套”。→：Lymphocyte infiltration； ☆：Vascular cuff.
图7 攻毒后扁桃体组织的剖检与镜检结果（400×）
Fig.7 Autopsy and microscopic examination of tonsil tissue after challenge（400×）
→：淋巴细胞坏死。 →：Necrotic lymphocyte.
猪伪狂犬病是由猪疱疹病毒引起的以发热、奇痒和脑脊髓炎为主要特征的急性传染病，该病严重制约养猪业的高质量发展。目前针对该病的防控，国内外均以疫苗免疫预防为主，结合配套的gE-ELISA抗体检测方法淘汰、净化野毒感染猪，从而实现伪狂犬病的净化。目前，临床应用的猪伪狂犬病疫苗可分为3类：一是经灭活加入佐剂制备的灭活疫苗；二是利用基因工程技术，使PRV的相关毒力基因无法表达，毒力致弱同时又保持较高免疫原性而制备的基因缺失疫苗；三是将分离得到的野毒株经异源细胞不断传代得到的自然传代弱毒疫
目前已报道的伪狂犬病自然传代弱毒疫苗有Bartha株、布加勒斯特株和BUK株等。其中匈牙利的Bartha株是将PRV强毒株在猪肾细胞、鸡胚上反复传代后获得的疫苗
本研究将野毒株JS18株经鸡胚成纤维细胞连续传代获得JS18-150株。病毒噬斑结果显示，相比JS18株，JS18-150株在细胞形成的空斑明显更大，表明JS18-150株在鸡胚成纤维细胞上适应性提高。测序结果显示，该毒株传代至第100代时缺失gI基因第269位至US9全部核苷酸，且挑取的单克隆继续传代至150代时，缺失部分稳定，均未发生改变。一步生长曲线结果显示JS18株和JS18-150株生长动力学相似，即JS18-150株在传代过程中虽发生缺失，但并不影响其增殖能力。安全性试验结果显示JS18株免疫组5/5仔猪出现精神不振、呼吸困难和食欲减退等临床症状，同时4/5仔猪死亡。而JS18-150株免疫组所有仔猪均未观察到任何临床症状，且体温正常，均未超过40.5 ℃。说明JS18-150株毒力显著下降，对仔猪有良好的安全性。中和抗体检测结果显示，免疫后28 d免疫组PRV中和抗体效价分别为（63.8±5.08）和（54.6±6.65），PRV-150株免疫猪体后刺激机体产生显著得抗体水平。攻毒保护试验结果显示，免疫组能100%抵御JS18株和HBZL05株的攻击，未出现任何临床症状，而攻毒对照组出现典型临床症状，且均5/5死亡。说明JS18-150株作为疫苗接种仔猪能够产生良好的交叉保护。
研究表明，猪伪狂犬病病毒编码的gE/gI蛋白可抑制Ⅰ型干扰素的产生，有利于自身复制，其中gE蛋白通过降解CBP从而阻碍其与IRF3结合来抑制IFN-β的产生，gI蛋白通过抑制IRF3的二聚化来抑制IFN-β的产
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