摘要
为研究SPL（SQUAMOSA-promoter binding protein-like）转录因子在矮牵牛成花转换中的作用，克隆矮牵牛PhSPL9b基因，并将该基因对应的miR156/157靶位点进行点突变获得rPhSPL9b，将PhSPL9b和rPhSPL9b分别构建超量表达载体，转化矮牵牛和拟南芥，最终获得拟南芥35S∶∶PhSPL9b与35S∶∶rPhSPL9b转基因植株以及矮牵牛35S∶∶PhSPL9b转基因植株。研究结果显示，过表达PhSPL9b和rPhSPL9b导致拟南芥莲座叶显著减少，花期明显提前，其中35S∶∶rPhSPL9b转基因表型更为明显；过表达PhSPL9b促进矮牵牛提前开花。RT-PCR和qRT-PCR分析结果显示，表型明显的转基因株系中，PhSPL9b基因表达量均显著高于对照。转录激活实验结果表明，PhSPL9b是一个具有转录激活活性的转录因子。以上结果表明，矮牵牛PhSPL9b基因对开花时间具有重要调控作用，其功能具有保守性，同时，它可能是通过转录激活下游基因的表达而影响植物开花。
开花是高等植物从营养生长到生殖生长状态的转变，这一过程决定植物能否成功繁殖子
SPL（SQUAMOSA-promoter binding protein-like）是植物中特异的一类转录因子，在植物营养生长和生殖生长过程中发挥着重要作
矮牵牛（Petunia hybrida）为茄科碧冬茄属的一、二年生草本花卉，花色绚丽、株型丰富、花期长，被誉为“花坛之王”。目前对矮牵牛的研究主要集中在花器官发育方
以矮牵牛W115株系（Petunia hybrida var. Mitchel diploid）和野生型（Col-0生态型）拟南芥（Arabidopsis thaliana）为试验材料。矮牵牛种植于华中农业大学花卉基地温室，常规管理。拟南芥种植于光照培养箱（光照强度2 000 lx、16 h光照/8 h黑暗，温度21~22 ℃，湿度75%）。
根据矮牵牛基因组和转录组数据鉴定的PhSPLs基
以35S∶∶PhSPL9b质粒为模板，设计并合成含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的特异引物克隆PhSPL9b基因。测序无误后，使用EcoRⅠ和BamHⅠ分别双酶切含有PhSPL9b的pMD18-T与酵母表达载体pGADT7和pGBKT7，用T4 DNA连接酶将双酶切后的表达载体与目的基因连接，构建pGADT7-PhSPL9b和pGBKT7-PhSPL9b表达载体。
所有构建的质粒都通过PCR检测筛选及双酶切进行验证。所用引物见
| 引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence | 用途 Usage |
|---|---|---|
| PhSPL9b-F | GTAATGAATAGGCACTTGACGTCAG |
PhSPL9b全长克隆 Full-length clone of PhSPL9b |
| PhSPL9b-R | GGCCATTCGTCGATAGAGCC | |
| rPhSPL9b-F1 | CAGAAATGGAACTAAGTTCAGTTTC |
rPhSPL9b第一段克隆 First segment clone of rPhSPL9b |
| rPhSPL9b-R1 | GGAAAGCAGTGATAGCGCTCCACTGGAGCCTGAGGCTCC | |
| rPhSPL9b-F2 | GGAGCGCTATCACTGCTTTCCAATCGGTCCTGGGAATCAAG |
rPhSPL9b第二段克隆 Second segment clone of rPhSPL9b |
| rPhSPL9b-R2 | GGCCATTCGTCGATAGAGCC | |
| PhSPL9b-F（EcoRⅠ） | CCGGAATTCATGAATAGGCACTTGACGTC |
PhSPL9b克隆，下划线为酶切位点 Full-length clone of PhSPL9b with underscores as cleavage sites |
| PhSPL9b-R（BamHⅠ） | CGGGATCCTTAAAGAGTCCAGTGAACAT | |
| M13-F | AGCGGATAACAATTTCACACAGG |
大肠杆菌菌落阳性检测 Positive test for E. coli colonies |
| M13-R | CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC | |
| AD-F | CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC |
酵母菌落阳性检测 Positive test for yeast colonies |
| AD-R | GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT | |
| BD-F | TCATCGGAAGAGAGTAG | |
| BD-R | GAGTCACTTTAAAATTTGTAT | |
| 35S-F | ACGCACAATCCCACTATCCTTC |
转基因植株阳性检测 Positive test for transgenic plants |
| PhSPL9b-R（short） | CAACCTTCAACTTGACATCTAGGTG | |
| PhEF1α-F | CCTGGTCAAATTGGAAACGG |
RT-PCR及qRT-PCR内参引物 Primers of actin genes by RT-PCR and qRT-PCR |
| PhEF1α-R | CAGATCGCCTGTCAATCTTGG | |
| AtEF1α-F | GCAAGATGGATGCCACTACCC | |
| AtEF1α-R | AGTGGGAGACGAAGGGGCT | |
| qPhSPL9b-F | TTCCTTCAGGAGACTGTTTCCCT | |
| qPhSPL9b-R | CTGCTGCTAGCTTCATTTCCTTTAA |
将PhSPL9b和rPhSPL9b基因表达载体质粒分别电转化至GV3101和AGL0农杆菌，通过花序侵染法和叶盘转化法分别转化拟南芥和矮牵牛，最终获得转基因植株，具体操作方法参照Zhou
在拟南芥转基因株系中，根据转基因植株的表型，每个载体各选择3个符合3∶1分离比的T2代转基因株系，将其后代在长日照植物光照培养箱中培养。当植株抽薹1 cm高时，统计分析每个株系35株转基因植株（T3代）的表型，如开花时间、莲座叶数目和茎生叶数目。
在矮牵牛转基因株系中，每个载体各选择3株表达量不同的T0代转基因植株，将其后代在长日照条件下种植。经PCR鉴定后，每个转基因株系各统计25株转基因植株（T1代）的表型，如开花时间、植株高度、叶片长宽比、叶片节间距、花朵直径和分枝数。
在拟南芥中，选取同一时期CK（空载pCAMBIA2300转化Col-0）未开花时的幼苗和T3代35S∶∶PhSPL9b和35S∶∶rPhSPL9b抽薹的转基因植株；在矮牵牛中，选取同一时期CK未开花时的顶芽和T2代35S∶∶PhSPL9b已分化出花序的顶芽，分别通过RT-PCR和qRT-PCR检测PhSPL9b在不同转基因株系中的表达情况。每个株系3个生物学重复。qRT-PCR的反应体系为10 μL：1 μL稀释10倍的反转录产物（cDNA），5.0 μL 2×SYBR Mixture，0.2 μL上游特异引物和0.2 μL下游特异引物（10 μmol/L），0.2 μL ROX，3.4 μL ddH2O。反应程序为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，55 ℃退火34 s，40次循环，以拟南芥AtEF1α和矮牵牛PhEF1α作为内参基
将pGBKT7-PhSPL9b和pGADT7、pGADT7-PhSPL9b和pGBKT7、pGBKT7-53和pGADT7-T（阳性对照）及pGBKT7-Lam和pGADT7-T（阴性对照）组合分别转化酵母菌株AH109，经SD/-Trp/-Leu筛选及阳性检测后，再在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade筛选。将各组合的阳性菌落在SD/-Trp/-Leu液体培养基中30 ℃ 220 r/min孵育24 h，稀释后使其OD600=1，菌液经3 500 r/min室温离心4 min后弃上清，用ddH2O重悬菌体，吸打混匀后将菌液稀释成5个浓度梯度，即1
序列分析结果显示，PhSPL9b基因编码区长度为1 125 bp，编码374个氨基酸。与矮牵牛基因组数
图1 PhSPL9b基因结构图
Fig. 1 Structure of PhSPL9b gene
经PCR扩增、测序、双酶切、连接等步骤，完成植物表达载体35S∶∶PhSPL9b和35S∶∶rPhSPL9b、酵母表达载体pGADT7-PhSPL9b和pGBKT7-PhSPL9b的构建（
图2 PhSPL9b相关表达载体构建
Fig. 2 Construction of PhSPL9b expression vectors
A： PhSPL9b相关表达载体结构示意图Schematic diagram of expression vector of PhSPL9b； B： PhSPL9b相关表达载体双酶切检测图Double digestion diagram of expression vectors of PhSPL9b.
将35S∶∶PhSPL9b和35S∶∶rPhSPL9b载体分别电转化至农杆菌GV3101和AGL0，通过花序侵染法转化拟南芥和叶盘法转化矮牵牛。经Kan筛选和PCR检测，获得42个拟南芥35S∶∶PhSPL9b转基因株系（图
图3 PhSPL9b转基因植株阳性检测
Fig. 3 Positive detection of PhSPL9b transgenic plants
A： 1~23， 拟南芥35S∶∶PhSPL9b转基因株系35S∶∶PhSPL9b Arabidopsis transgenic lines； B： 1~24， 矮牵牛35S∶∶PhSPL9b转基因株系35S∶∶PhSPL9b transgenic petunia lines. C：1~17， 拟南芥35S∶∶rPhSPL9b转基因株系35S∶∶rPhSPL9b Arabidopsis transgenic lines. P：质粒阳性对照 Plasmid positive control； CK：空载阴性对照 Negative control； Blank：空白对照 Blank control.
表型统计发现，在拟南芥转基因植株中，36株35S∶∶PhSPL9b转基因T1代植株和29株35S∶∶rPhSPL9b转基因T1代植株表现出早花表型，其中35S∶∶PhSPL9b转基因植株的平均提前开花时间为4.9 d，35S∶∶rPhSPL9b转基因植株的平均提前开花时间为8.1 d。如
图4 PhSPL9b超量表达拟南芥表型分析
Fig. 4 Phenotypes of the transgenic Arabidopsis plants overexpressing PhSPL9b
A~B： 转基因植株表型（标尺=10 mm） Phenotype of transgenic plants about 3-weeks-old（scale=10 mm）； C~D： 转基因株系中PhSPL9b基因的表达量Expression level of PhSPL9b in transgenic lines； E~F： 转基因株系的抽薹时间和莲座叶数量 Bloting time and number of rosette leaves in transgenic lines.*和**分别表示在0.05和0.01水平上差异显著，下同。 * and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels， the same as follows.
株系 Lines | 莲座叶数目 Rosette leaves No. | 茎生叶数目 Cauline leaves No. | 抽薹时间/d Bolting time |
|---|---|---|---|
| CK | 11.57±0.80 | 2.14±0.17 | 26.27±0.78 |
| PhSPL9b#13 |
9.03±1.2 | 2.03±0.23 |
20.72±1.5 |
| PhSPL9b#19 | 9.96±0.78 | 2.24±0.34 |
22.31±1.7 |
| PhSPL9b#21 |
9.29±1.1 | 2.15±0.21 |
20.98±1.6 |
| rPhSPL9b#8 |
8.86±1.5 | 2.34±0.36 |
18.76±0.8 |
| rPhSPL9b#12 |
8.14±1.2 | 2.37±0.10 |
17.37±0.6 |
| rPhSPL9b#26 |
8.73±1.5 | 2.28±0.42 |
18.45±0.7 |
注： *和**分别表示在0.05和0.01水平上差异显著，下同。Note： * and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels，the same as follows.
图5 rPhSPL9b超量表达拟南芥表型分析
Fig. 5 Phenotypes of the transgenic Arabidopsis plants overexpressing rPhSPL9b
A~B： 转基因植株表型 （标尺=10 mm） Phenotype of transgenic plants about 3-weeks-old （scale=10 mm）； C~D： 转基因株系中PhSPL9b基因的表达量 Expression level of PhSPL9b in transgenic lines ； E~F： 转基因株系的抽薹时间和莲座叶数量 Bloting time and number of rosette leaves in transgenic lines.
在矮牵牛转基因植株中，27株T0代35S∶∶PhSPL9b转基因植株的开花时间较CK提前，开花时间平均提前7.6 d。如
图6 PhSPL9b超量表达矮牵牛表型分析
Fig. 6 Phenotypes of the transgenic petunia plants overexpressing PhSPL9b
A： 转基因植株表型Phenotype of transgenic plants about 10-weeks-old （scale=10 mm）； B~C： 转基因株系中PhSPL9b的表达量 Expression level of PhSPL9b in transgenic lines； D： 转基因株系的开花时间Flowering time of transgenic lines.
株系 Lines | 开花时间/d Flowering time | 植株高度/cm Plant height | 叶片长宽比 Leave length/width ratio | 节间距/cm Internode length | 花朵直径/cm Flower diameter | 分枝数 Number of branches |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 65.81±1.64 | 60.81±2.59 | 2.34±0.17 | 3.02±0.23 | 5.31±0.11 | 2.13±0.21 |
| PhSPL9b#7 |
59.23±4.3 | 62.42±3.12 | 2.29±0.32 | 2.92±0.25 | 5.33±0.32 | 2.36±0.23 |
| PhSPL9b#13 |
58.72±3.5 | 62.73±2.43 | 2.30±0.16 | 3.07±0.31 | 5.30±0.41 | 2.30±0.16 |
| PhSPL9b#28 |
56.63±2.9 | 63.63±3.31 | 2.36±0.25 | 2.89±0.28 | 5.24±0.37 | 2.18±0.34 |
将质粒组合pGBKT7-PhSPL9b+pGADT7、pGADT7-PhSPL9b+pGBKT7、pGBKT7-53+pGADT7-T（阳性对照）及pGBKT7-Lam+pGADT7-T（阴性对照）分别转化到酵母菌株AH109，结果发现，阳性对照pGBKT7-53+pGADT7-T和pGBKT7-PhSPL9b+pGADT7共转后的酵母单菌落在SD/―Trp/―Leu和SD/―Trp/―Leu/―His/―Ade上正常生长，并在SD/―Trp/―Leu/―His/―Ade/X-α-gal上发生显色反应（蓝色），而pGADT7-PhSPL9b+pGBKT7和pGBKT7-Lam+pGADT7-T（阴性对照）共转后的酵母单菌落在SD/―Trp/―Leu上正常生长，但在SD/―Trp/―Leu/―His/―Ade不能正常生长，也不能在SD/―Trp/―Leu/―His/―Ade/X-α-gal上发生显色反应（
图7 PhSPL9b转录激活特性分析
Fig. 7 Analysis of transcriptional activation characteristics of PhSPL9b
开花是观赏植物的重要性状，决定着观赏植物的品质和经济价
本研究构建35S∶∶PhSPL9b和35S∶∶rPhSPL9b超量表达载体并转化矮牵牛和拟南芥，结果显示PhSPL9b和rPhSPL9b超量表达拟南芥后，转基因植株的开花时间显著提前，莲座叶数目减少；35S∶∶PhSPL9b矮牵牛转基因植株的开花时间与对照相比也显著提前，这表明PhSPL9b对开花时间具有重要的调控作用。Xu
基因表达分析研究结果表明，转基因植株的表达量和表型强弱密切相关，且rPhSPL9b作用更显著。Xu
转录因子能发挥有效调控的必要前提是具有转录活
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