摘要
为培育高抗草甘膦作物以应对草甘膦杂草进化，从海洋细菌中筛选到1株高抗草甘膦的盐单胞菌属菌株（Halomonas sp.），通过基因组测序及生物信息学分析，确定该菌株的EPSPS基因，在Escherichia coli（DE3）中对fHoEPSPS、mfHoEPSPS（G384A位点突变）和mHoEPSPS（mfHoEPSPS N端缺失PDT）进行重组表达和纯化，并运用自切割肽LP4/2A介导的基因聚合策略，将抗草铵膦的酶（Repat）置于mHoEPSPS的N端，构建了双抗草甘/铵膦酶（RLH），将其编码基因导入烟草后赋予草甘/铵膦复合抗性。结果显示，该菌株的EPSPS基因（fHoEPSPS）可编码一个N段融合了预苯酸脱水酶（PDT）的双功能酶。草甘膦抗性分析显示mfHoEPSPS的抗性比fHoEPSPS提高了19倍，将mHoEPSPS基因导入烟草后可赋予烟草3倍推荐剂量的草甘膦耐受性，转RLH基因的烟草能够耐受3~5倍推荐剂量的草甘/铵膦复合除草剂。结果表明，源于Halomonas sp.的抗草甘膦EPSPS是一种新型草甘膦耐受酶，通过G384A的位点突变可提高酶活；利用自切割肽介导的基因堆叠策略获得的转RLH基因烟草表现出较高草甘/铵膦复合抗性。
草甘膦和草铵膦是全球广泛使用的2种灭生性除草剂，具有高效、低毒、广谱等优点。前者通过竞争性抑制植物莽草酸途径关键酶5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS；EC 2.5.1.19），导致植物芳香族氨基酸合成受阻而死
全球超过20 a的产业化实践充分证明，耐除草剂（herbicide tolerant，HT）作物对于农业节能减排、增产增收、环境保护均具有重要的贡
挖掘具有自主知识产权且性能优异的耐除草剂基因资源，是HT作物培育与产业化的关键。我国在耐草甘膦基因资源方面有一定积累，克隆了多个新的草甘膦耐受基因，主要包括2种类型：一种为对草甘膦耐受的EPSPS合酶，如Deinococcus radioduran来源的G10evo‑EPSP
耐草甘膦性状长期主导HT作物，草甘膦的长期广泛使用导致抗性杂草的进化和漫延，成为HT作物应用的新挑
通过基因聚合策略，培育耐不同除草剂的HT作物，进而通过不同除草剂的轮用来应对抗性杂草，可有效地解决这一挑战。此外，复合抗性HT作物与复合除草剂联用，对于控制田间已有抗性杂草至关重要。草铵膦除了具有与草甘膦类似的广谱、低毒优点外，还具有见效快的优势。近年来，伴随着精草铵膦酶促合成的工艺日趋完善，成本逐年降低，草铵膦价格将很快媲美草甘膦。因此，培育草甘/铵膦多抗除草剂作物具有广阔的应用前景。
鉴于此，本研究在挖掘新的草甘膦耐受基因的同时，基于自切割肽介导的多顺反子表达策
大肠杆菌（E. coli）DH5α、E. coli ZD11（epsps基因缺陷型菌株）、E. coli BL21（DE3）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101保存于华中农业大学酶分子工程实验室。草铵膦乙酰转移酶基因（Repat）为实验室前期克隆。
将实验室保藏的海洋菌株活化后接种于含有200 mmol/L草甘膦的2216E培养基（青岛日水生物科技有限公司）平板进行初筛；初筛的菌株单菌落进一步划线接种到含有0、100、200、300 mmol/L草甘膦的M9基础培养基上，筛选到1株能在300 mmol/L高草甘膦浓度条件下生长的菌株；提取该菌株基因组DNA并送至上海派诺森生物有限公司进行测序分析。
根据基因组序列信息，利用Snapgen 4.3.6设计引物fHoEPSPS-F和fHoEPSPS-R扩增该菌株EPSPS基因（fHoEPSPS）的ORF，引物序列信息见
引物 Primers | 引物序列(5′→3′) Primer sequences | 用途 Usage |
|---|---|---|
| fHoEPSPS-F | GGAATTCATGGCCGCTGCGCTTCGCGT |
fHoEPSPS基因扩增 Amplification of fHoEPSPS |
| fHoEPSPS-R | CCGCTCGAGTTAGTGGTCATTGGCACC | |
| MutaHo-F | TGTATGTAGGTAACTCTGCAACCGCCATGCGCCTGTTTGC |
mfHoEPSPS表达载体构建 Construction of mfHoEPSPS expression vector |
| MutaHo-R | TGCAGAGTTACCTACATACAGCGGGCCTGCCG | |
| mHo-F | ATGTTGAACAAAACCAGTTATCAGGCGG |
mHoEPSPS表达载体构建 Construction of mHoEPSPS expression vector |
| mHo-R | TAACTGGTTTTGTTCAACATGAATTCCGGGGATCCCAG | |
| Repat-F | GTTCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGCTGATTCGTGATG |
RLH基因扩增 Amplification of RLH |
| Repat-R | CATCTGCTGCATTGCTCAGGGTCAGCTGCAGATAG | |
| LP4/2A-F | AGCAATGCAGCAGATGAAGTTGCAACACAGCT | |
| LP4/2A-R | GGTTTTGTTCAACATCGGACCCGGATTG | |
| mHoEPSPS-F | ATGTTGAACAAAACCAGTTATCAGGCGG | |
| mHoEPSPS-R | GCTCGAGTCGACCCGGGAATTCTTAGTGGTCATTGGCACCCTCCAC | |
| HoEPSPS-F | GGGGTACCATGGCTCAGGTTTCCAGG |
转基因载体构建 Construction of transgenic vector |
| HoEPSPS-R | CGGGATCCTCAGTGGTCGTTAGCACCC | |
| RLH-F | GAGCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGGATCTATGCTCATTAG | |
| RLH-R | CAGGTCGACTCTAGAGGATCCTCAGTGATCGTTAGCACC | |
| hpt557-F | ACACTACATGGCGTGATTTCAT |
烟草转基因阳性株鉴定 PCR identification of transgenic tobacco |
| hpt557-R | TCCACTATCGGCGAGTACTTCT |
通过PCR介导的定点突变技术，设计引物MutaHo-F和MutaHo-R将fHoEPSPS的第384位G突变为A，构建pGEX-6p-mfHoEPSPS重组质粒。通过设计互为同源臂的引物mHo-F、mHo-R，以pGEX-6p-mfHoEPSPS为模板，扩增除PDT基因的部分，利用ClonExpress MultiS一步法重组试剂盒（诺唯赞，南京）构建不含PDT的pGEX-6p-mHoEPSPS重组质粒。
利用带有载体同源臂的引物Repat-F和Linker LP4/2A同源臂引物Repat-R扩增Repat基因，利用引物LP4/2A-F和带有mHoEPSPS同源臂的LP4/2A-R引物扩增Linker LP4/2A，利用引物mHoEPSPS-F和带有载体同源臂的引物mHoEPSPS-R扩增mHoEPSPS基因，引物序列信息见
将pGEX-fHoEPSPS、pGEX-mfHoEPSPS和pGEX-mHoEPSPS转化至E. coli BL21（DE3），挑取含有重组质粒的单菌落，接种到10 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，180 r/min 37 ℃过夜振荡培养。以1%的接种量转接至500 mL LB液体培养基，37 ℃培养2~3 h，当OD600达0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside， IPTG）至终浓度为 0.1 mmol/L，18 ℃，180 r/min诱导培养16 h。诱导完成后，7 500 r/min离心10 min收集菌体，用预冷的HEPES缓冲液（pH 7.0）洗涤菌体，离心去上清液，洗涤2遍，再用100 mL新鲜HEPES缓冲液充分悬浮菌体，用低温高压破碎仪（JNBIO JN-3000PLUS，广州聚能纳米生物科技股份有限公司）破碎细胞，收集细胞破碎液后12 000 r/min、4 ℃离心60 min，收集上清液，进行GST亲和层析纯
将含有pGEX-6p-fHoEPSPS、pGEX-6p-mfHoEPSPS、pGEX-6p-mHoEPSPS、pGEX-6p-RLH、pGEX-6p-Repat质粒的菌株E. coli ZD11接种至含氨苄青霉素LB培养基中，于37 ℃过夜培养，洗涤2遍除去LB营养成分，调整菌体浓度OD600 至1.0，按2%转接量转接于含有不同浓度（0、100、200 mmol/L）草甘/铵膦的液体M9基础盐培养基中，每组设置3个重复。用Bioscreen全自动生长曲线分析仪检测菌株的生长状况，设置测定时间为2 d，培养温度为37 ℃。
半抑制剂量（IC50）能直观反映出酶对抑制剂的耐受性。设置20 μL的反应体系：2 μL 1 mmol/L 莽草酸-3-磷酸（S3P，Sigma，上海），2 μL 1 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP，Sigma，上海），2 μL纯酶，加不同浓度梯度（1
为分析基因mHoEPSPS及RLH在植物中除草剂抗性水平，本研究将mHoEPSPS及RLH基因按照烟草密码子的偏好性进行优化合成（由武汉金开瑞生物工程有限公司合成）。以优化合成的序列为模板利用引物对（mHoEPSPS-F和mHoEPSPS-R）扩增mHoEPSPS基因；利用引物对（RLH-F和RLH-R）扩增RLH基因，PCR产物分别回收后，与KpnⅠ和 BamH Ⅰ线性化的载体pCAMBIA1300混合，利用 ClonExpress II One Step Cloning Kit 通过同源重组，分别构建烟草转化载体pCAMBIA1300-mHoEPSPS和pCAMBIA1300-RLH。以‘岩烟97’为受体，通过农杆菌介导叶盘转化法，分别构建含mHoEPSPS和RLH的转基因烟草（Nicotiana benthamiana）。提取具有潮霉素抗性的转化体的叶片组织DNA，利用潮霉素抗性基因特异性引物hpt557-F和hpt557-R（
野生型和转基因株系温室生长至6~9叶期时，用2%（商业推荐剂量为0.5%）的农达（41%草甘膦异丙胺盐）喷施处理转mHoEPSPS烟草；转RLH烟草叶片分别喷洒2%的农达和40%草甘膦·草铵膦复合除草剂（济南兄弟作物科学有限公司），7 d后观察并记录植株的生长与药害情况。
本研究通过菌株抗性筛选获得1株能在含有300 mmol/L草甘膦培养基中生长的菌株（
图1 抗性菌株分离及基因分析
Fig. 1 Isolation of Halomonas sp. and gene structure of fHoEPSPS
A：抗性菌株分离Original strain isolation by growing on M9 medium supplied with 300 mmol/L glyphosate；B：fHoEPSPS基因组成分析Analysis of gene structure of fHoEPSPS；C：HoEPSPS进化树分析 Phylogenetic analysis of HoEPSPS.
提取菌株总DNA，进行测序分析，根据全基因组测序结果及注释，获得了草甘膦靶酶EPSPS（fHoEPSPS）的基因结构信息，该基因长度为2 202 bp，GC含量60%，可编码733个氨基酸，蛋白质分子质量理论大小为78.25 ku，与已报道的EPSPS蛋白分子质量有较大差异。蛋白序列分析发现该蛋白N端融合了预苯酸脱水酶（PDT），由272个氨基酸残基组成，分子质量为29.45 ku；C端含有EPSPS结构域，包括461个氨基酸残基，分子质量为48.80 ku（
为评价该酶序列新颖性，考虑到fHoEPSPS中PDT结构域会对多序列比对结果产生影响，选择将fHoEPSPS中不包含PDT的部分（命名为HoEPSPS）与已报道的4类EPSPS进行多序列比对，利用软件MEGA 6构建进化树，分析不同酶的序列一致性，结果如
对比fHoEPSPS和其他4类EPSPS氨基酸序列，发现他们均具有1个保守motif：-382N383S384G385T386A387M-。前期研究结果表明，该motif中的甘氨酸残基与草甘膦的抗性密切相
本研究首先纯化fHoEPSPS及mfHoEPSPS蛋白，由
图2 fHoEPSPS、mfHoEPSPS和mHoEPSPS蛋白纯化
Fig. 2 Purification of fHoEPSPS， mfHoEPSPS and mHoEPSPS
A：fHoEPSPS蛋白纯化 Purification of fHoEPSPS。1：蛋白分子质量标记 Protein marker；2：纯化后的fHoEPSPS Purified fHoEPSPS；B：mfHoEPSPS蛋白纯化Purification of mfHoEPSPS。1：蛋白分子质量标记Protein marker；2：纯化后的mfHoEPSPS Purified mfHoEPSPS；C：mHoEPSPS蛋白纯化Purification of mHoEPSPS。1：蛋白分子质量标记Protein marker；2：纯化后的mHoEPSPS Purified mHoEPSPS.
图3 IC50比较
Fig. 3 Comparison of IC50
A：IC50曲线 IC50 curve； B：IC50值 IC50 values.
将笔者所在实验室开发的草铵膦抗性基因Repat置换掉其N端的PDH编码区，添加自切割的linker LP4/2A，构建融合基因RLH，以期实现“一个基因，两种抗性”。由
图4 融合表达模式图
Fig. 4 Fusion expression pattern
为了验证融合基因功能，本研究将RLH亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1，转化E. coli ZD11感受态细胞，对其草甘/铵膦抗性进行验证。由
图5 RLH的生长曲线
Fig. 5 The growth curve of RLH
A：不含草甘膦的基础盐培养基 Basic salt medium without glyphosate； B：含100 mmol/L草甘膦的基础盐培养基 Basic salt medium with 100 mmol/L glyphosate； C：含200 mmol/L草甘膦的基础盐培养基 Basic salt medium with 200 mmol/L glyphosate； D：不含草铵膦的基础盐培养基 Basic salt medium without glufosinate； E：含100 mmol/L草铵膦的基础盐培养基 Basic salt medium with 100 mmol/L glufosinate；F：含200 mmol/L草铵膦的基础盐培养基 Basic salt medium with 200 mmol/L glufosinate.
将mHoEPSPS和RLH基因插入到植物表达载体pCAMBIA1300，获得烟草转化载体（
图6 烟草转化载体构建示意图及转基因烟草抗性验证
Fig. 6 Schematic diagram of plant vector construction and transgenic tobacco resistance verification
A：mHoEPSPS转化载体构建示意图Schematic diagram of mHoEPSPS transformation vector construction；B：RLH转化载体构建示意图Schematic diagram of RLH transformation vector construction；C：mHoEPSPS转基因烟草农达抗性验证Validation of Roundup resistance in mHoEPSPS transgenic tobacco， 1：0.5%的农达处理野生型烟草WT treated by 0.5% Roundup； 2：1.6%的农达处理mHoEPSPS转基因烟草mHoEPSPS transgenic tobacco treated by 1.6% Roundup； 3：2%的农达处理mHoEPSPS转基因烟草mHoEPSPS transgenic tobacco treated by 2% Roundup；D：2%的农达处理RLH转基因烟草RLH transgenic tobacco treated by 2% Roundup；E：RLH转基因烟草草甘膦·草铵膦抗性验证Validation of glyphosate·glufosinate resistance in RLH transgenic tobacco； 1：0.1%的草甘膦·草铵膦处理野生型烟草WT treated by 0.1% glyphosate·glufosinate； 2：0.3%的草甘膦·草铵膦处理RLH转基因烟草RLH transgenic tobacco treated by 0.3% glyphosate·glufosinate； 3：0.5%的草甘膦·草铵膦处理RLH转基因烟草RLH transgenic tobacco treated by 0.5% glyphosate·glufosinate.
EPSPS广泛存在植物、细菌及真菌中。植物来源的EPSPS普遍对草甘膦敏感，而某些微生物尤其是细菌中EPSPS对草甘膦具有抗性，成为抗草甘膦基因资源的主要来源。长期以来，人们更多的是关注土壤微生物来源抗草甘膦EPSPS的克
通过多序列比对发现去掉PDT部分的酶（HoEPSPS）与CP4-EPSPS序列一致性仅为41.47%，与其他商业化应用的EPSPS序列一致性小于30%，是一个新型的草甘膦耐受酶。全长酶fHoEPSPS和HoEPSPS均能在E. coli细胞中可溶性表达。序列分析表明，fHoEPSPS同样含有在EPSPS中广泛存在的motif：-382N383S384G385T386A387M-，该motif中的甘氨酸残基与草甘膦抗性相
抗草甘膦作物长期主导耐除草剂作物产业，然而全球耐草甘膦杂草多达58种，且有逐年增加的趋势，对耐草甘膦作物的持续发展提出了挑战；而已报道的草铵膦抗性杂草目前只有6
本研究利用自切割肽介导的基因堆叠策略，构建了抗2种除草剂的单基因。目前不同抗除草剂基因堆叠的主要策略为使用多个表达框进行共转化，存在载体构建繁琐，重复表达元件遗传不稳定，不同蛋白的表达比例可能失衡等弊端。本研究的2个抗性基因只需要一个表达框，即可实现1∶1的稳定表达，具有明显的优势，这为其他抗除草剂基因的堆叠提供了借鉴。另外，超表达RLH的烟草能够耐受3~5倍，较高的抗性水平意味着RLH具有较大的应用潜力。在后续研究中，可以在不同作物中测试其抗性水平，进而利用该基因培育抗草甘/铵膦的耐除草剂作物。
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