摘要
为鉴定和发掘玉米渍水胁迫抗性基因，克隆玉米ERF家族成员ZmEREB46（Zm00001d015759）基因，同时对该基因进行重测序分析、功能变异位点鉴定以及表达模式分析，并进一步在模式植物拟南芥中初步探究ZmEREB46参与耐渍的功能。结果显示，ZmEREB46编码1个AP2/EREBP类转录因子；相较于耐渍自交系A3237，ZmEREB46基因编码区及启动子区在渍水敏感自交系A3239中分别存在1个G/A的转换以及1个911 bp片段插入，911 bp片段的插入显著抑制了渍水敏感自交系A3239中ZmEREB46基因的表达；亚细胞定位结果显示，ZmEREB46定位在细胞核中；荧光定量PCR结果显示，ZmEREB46受渍水胁迫诱导上调表达，渍水处理8 h后ZmEREB46在耐渍自交系A3237中的表达量是渍水敏感自交系A3239中的2倍。结果表明，ZmEREB46在拟南芥中过量表达提高了拟南芥苗期的耐渍性。
我国玉米产区主要集中在东北和华北，降水时期多在玉米苗期到开花期，此阶段玉米对涝渍胁迫最为敏感，极易造成生长发育受阻，影响后期产量形成，每年因暴雨和洪水造成大面积涝渍灾害，产量和经济损失巨大。因此，鉴定和发掘玉米渍水胁迫抗性基因，探究其生物学功能及其在涝渍胁迫中的分子机制，对玉米分子育种具有重要意义。
玉米、小麦、大麦、大豆、棉花等旱地作物常面临着渍水带胁
AP2/ERF家族相关蛋白依据AP2 domain的数量和结构分为3个亚类： APETALA2（2个AP2域）、RAV（与abscisic acid insensitive 3/ Viviparous 1，ABI 3/VPI相关）和ERF（ethylene-responsive factor
Xu
AP2/EREBP类家族成员是植物逆境胁迫相关的重要基因，然而玉米中参与耐渍的AP2/EREBP类基因鲜有报道。前期研究结合QTL定位、转录组分析和生物信息学等方法在玉米5.04 bin耐渍主效QTL区间内，定位、鉴定了1个关键耐渍候选基因ZmEREB4
玉米自交系A3237与A3239由华中农业大学玉米研究团队邱法展课题组自育，A3237耐渍性强，A3239涝渍敏感。
本研究所用的拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）材料为哥伦比亚生态型（Columbia）。
拟南芥过表达载体以pC1300st为骨架，经部分片段替换改造而成，含有潮霉素及卡那霉素抗性筛选标记基因。农杆菌转化菌株为GV3101和玉米原生质体瞬时表达载体pM999，笔者所在实验室保存。
大肠杆菌转化感受态DH5α以及农杆菌转化感受态EHA105购买自上海唯地生物技术有限公司。
ZmEREB46是ERF第五亚家族基因，根据B73参考基因组序列，利用在线网站Primer3Plus（http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）设计引物，以B73、A3237和A3239的基因组DNA以及cDNA为模板，克隆ZmEREB46基因。
载体构建和玉米原生质体转化步骤参照文献［
通过NCBI查询ZmEREB46在各个物种中已报道的同源基因，将相应的氨基酸序列全长整理为Fasta格式，导入MEGA-X进化树构建软件，采用默认程序通过Clustal W进行序列比对，用邻近法（neighbor joining， NJ）构建进化树（bootstrap 1 000次重复）。
所用载体由CaMV 35S组成型表达强启动子、多克隆酶切位点、绿色荧光蛋白（EGFP）、氨苄抗性核酸序列组成，共定位核Marker基因为拟南芥中的核基因AtHY5，Marker蛋白与红色荧光蛋白（RFP）融合。首先，构建ZmEREB46亚细胞定位载体，基因扩增引物为PM999EREB46-F：ACTCTAGCAGATCTATCGATTCTAGAATGACAGAGAATCTCCACTCCA；PM999EREB46-R：TCTTCTCCTTTGCCCATGGCTCTAGAGATGATGAAGCGACCTTGGT，载体检测引物：PM999-F：TCCACTGACGTAAGGGATGACGCA；PM999-R：GCATGGCGCTCTTGAAGAAGTCGT。以B73 cDNA为模板，克隆ZmEREB46，胶回收产物。载体目的基因插入酶切位点选用XbaⅠ（TCTAGA）。同源重组试剂盒采用诺唯赞公司ClonExpressII/One Step Clone Kit。将ZmEREB46亚细胞定位载体、核Marker通过PEG/C
玉米自交系A3237、A3239幼苗生长到2叶1心（包括子叶）时进行渍水处理（水面没过玉米茎部生长点），于处理后不同时间段取根与叶组织（每5株混样）用锡纸包裹后迅速放入液氮，提取总RNA，采用诺唯赞公司试剂盒HiScript Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）反转录，cDNA稀释5倍后作为模板。实时荧光定量PCR反应用酶为北京艾德莱公司生产的2×Sybr Green qPCR Mix，所用引物GM46-Qpcr-F：CAATCCAAAGAAGCAGCACA，GM46-Qpcr-R：GTGGGACTTCTCAGGGTCAA；ZmActin-F：AATGACGCAGATTATGTTTGAAAC，ZmActin-R：TGTGAGGATCTTCATTAGGTGGT。
设计带pC1300st载体同源臂的引物，以B73 cDNA为模板，扩增目的基因ZmEREB46。胶回收后获得带有同源臂的目的片段。酶切载体质粒，获得线性化pC1300st载体，将目的基因与载体同源重组，以pC1300st-F/R为引物，通过菌落PCR鉴定检测携带目的基因的阳性克隆，通过测序验证目的基因序列正确性后提取质粒。通过电转法转入GV3101农杆菌感受态中，阳性农杆菌菌液与50%灭菌甘油体积比1∶1混合，-80 ℃保存菌种。
取适量拟南芥种子于离心管内，用75%乙醇消毒1 min，用10%次氯酸钠表面消毒3次，用灭菌水清洗5次。将消毒后的种子均匀地涂抹在潮霉素抗性1/2 MS培养皿（MS 2.215 g/L、30 g/L蔗糖、10 g琼脂粉、NaOH调pH到5.6~5.8）上，于超净台风干，覆盖后用封口膜封口，培养室放置10 d初步筛选出阳性苗。挑选阳性苗转移到1/2无抗MS培养皿上培养2~3 d，移栽，盖膜培养2 d后揭膜，注意保持土壤湿润。待植株抽薹后，取适量叶片提取RNA，用引物扩增目的基因，根据条带亮度的强弱初步判断基因的表达水平。
1）材料种植。将营养土与蛭石以质量比2∶1混合后加水至土壤湿润（捏后出水不滴落），在10 cm×10 cm方盆里均匀洒落几十颗种子盖膜培养，3~4 d出苗后揭膜，培养10 d左右，将幼苗移栽到7 cm×7 cm方盆中，每盆4株，移苗后盆外浇水盖膜保持土表湿润，1 d后揭膜。每周浇水2次，施1次速溶复合肥，移栽后约20 d植株达到处理要求。
2）淹水处理。种植2个超表达材料OE1、OE2，加水淹没植株（水面距离植株10 cm），置于23 ℃培养箱暗培养。
3）存活率统计。将淹水处理48 h后的盆栽取出，置于23 ℃恒温光照培养室复氧培养，10 d后统计植株存活情况，长出新叶即算植株存活。
4）拟南芥地上部莲座部分干质量测定。将淹水处理48 h后的拟南芥取出，完整取下地上部分莲座部分，清洗干净叶片上附着的泥土，用吸水纸吸干水分，用硫酸纸袋包裹，放于65 ℃烘箱烘干24 h后，测定拟南芥地上部莲座部分干质量。
5）DAB染色。DAB染色液质量浓度为1 mg/mL，pH调至3.8，在配好的DAB染色液中加入0.5 μL/mL吐温20。取新鲜处理后的叶片放入染色液中浸没，在黑暗环境下静置5~10 h，使染色充分。将叶片转移到无水乙醇中煮沸脱色，脱色后的叶片为棕黄色，通过颜色深浅和染色面积判断H2O2含量。
6）MDA含量的测定。参照文献［
以玉米自交系B73的基因组DNA及cDNA为模板，克隆ZmEREB46的基因组序列。结果显示，基因序列全长为1 087 bp，编码区序列长度642 bp，含有2个外显子和1个内含子。进一步利用高世代玉米重组自交系A3237和A3239对ZmEREB46进行重测序，结果显示，在基因编码区（起始密码子下游556 bp处）存在1个SNP位点变异（G/A），导致第186位氨基酸由丙氨酸（A3239）变为苏氨酸（A3237）；同时，ZmEREB46在A3239中起始密码子上游2 kb的位置相对于A3237中存在1个911 bp的大片段插入（
图 1 ZmEREB46基因结构和启动子顺式元件分析
Fig. 1 Gene structure and cis-regulatory element analysis of ZmEREB46
A：ZmEREB46基因的结构示意图与多态性位点；B：ZmEREB46基因启动子顺式元件分析，Indel表示ZmEREB46启动子在A3239中插入片段。A： The schematic diagram and polymorphism sites of ZmEREB46；B：Cis-element analysis of ZmEREB46 gene promoter，Indel indicates the ZmEREB46 promoter inserted the fragment in A3239.
对ZmEREB46启动子2 kb序列进行顺式调控元件分析，结果显示，基因启动子序列含有厌氧响应元件（ARE、GC-motif、G-box）、干旱响应元件（MBS）以及多个激素（GA、ABA、MeJA、IAA）相关响应元件。同时，在A3239中ZmEREB46启动子序列中插入部分有3个G-box、1个脱落酸响应元件和1个生长素响应元件，新增2个GA响应元件P-box（
为鉴定大片段插入对ZmEREB46表达的影响，分别克隆了2个自交系A3237与A3239中ZmEREB46的启动子片段，构建了由花椰菜花叶病毒的最小启动子（mpCaMV）驱动的LUC表达载体，并比较LUC在玉米叶肉原生质体中的活性（
图2 A3237和A3239中ZmEREB46启动子活性差异
Fig. 2 The difference of ZmEREB46 promoter activity in A3237 and A3239
A： 载体结构。B：启动子活性分析。数据以平均值和标准误表示，相对于空载的均值均一化处理；采用t检验进行差异显著性分析，**：P<0.01。A： Plasmid structure. B： Promoter activity. The data are normalized with respect to the average values of the empty construct and are shown as means ± Sd. Significant differences are estimated by t-test（**：P<0.01）.
进化树分析结果（
图 3 ZmEREB46系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of ZmEREB46
将ZmEREB46报告载体35S∷ZmEREB46-EGFP（ZmEREB46-EGFP）和连有细胞核marker基因AtHY5的报告载体35S∷AtHY5-RFP（AtHY5-RFP）转化到玉米原生质体中共表达，在共聚焦显微镜下观察，绿光荧光和红光荧光共定位于细胞核，表明ZmEREB46蛋白定位在细胞核中（
图4 ZmEREB46亚细胞定位
Fig. 4 Subcellular localization of ZmEREB46
利用qRT-PCR对ZmEREB46在A3237、A3239苗期渍水处理0、2、4、6、8、10、12 h后叶片和根系中的表达量进行分析（
图5 ZmEREB46在A3237和A3239苗期渍水处理后叶片和根部相对表达量
Fig.5 Differences in relative expression patterns of ZmEREB46 in leaves and roots at different stages after waterlogging treatment at the seedling stage of A3237 and A3239
A：ZmEREB46在叶片中的表达模式； B：ZmEREB46在根部的表达模式。A：Expression pattern of ZmEREB46 in leaves； B：Expression pattern of ZmEREB46 in roots.
期间ZmEREB46在A3239中表达量无显著变化。ZmEREB46的表达差异可能是造成A3237和A3239苗期耐渍性差异的原因。
对ZmEREB46超表达材料经过2代筛选获得的纯合阳性植株（（
图 6 超表达ZmEREB46拟南芥材料耐淹性分析
Fig. 6 Analysis of submergence tolerance of Arabidopsis overexpressing ZmEREB46
A：ZmEREB46基因拟南芥T1代（检测纯合体表达量）转基因超表达植株半定量RT-PCR检测；B：将移栽后20~22 d的拟南芥进行暗淹水处理。Submergence：淹水处理48 h后复氧1 d；Reoxygenation：淹水处理48 h后复氧10 d摄。C：DAB染色。D：MDA 含量检测：淹水处理24 h后MDA含量，每个株系4个重复。E：淹水处理48 h后植株干质量。F：植株复氧10 d后存活率。WT：野生型植株；OE：超表达植株。用t-test对WT和OE进行差异显著性分析；*：P<0.05，**：P<0.01。A： RT-PCR was used to detect overexpressed plants of ZmEREB46 gene in Arabidopsis in T1 generation （after homozygote and then detection of expression leve； B： The Arabidopsis has been cultured for 20-22 d after transplanting is treated with water in dark. Submergence： Submergence treatment for 48 h， then reoxygenation treatment for 1 d； Reoxygenation： Submergence treatment for 48 h， reoxygenation treatment for 10 d. C： DAB staining. D：MDA content after 24 h of submerged treatment， 4 replicates per plant. E：Dry matter mass of plants after 48 h of submerged treatment. F：Survival rates： survival rate of plants after 10 d of reoxygenation. WT：Wild type； OE：Overexpression.Use t-test to analyze the significance of the difference between WT and OE，*：P<0.05，**：P<0.01.
ZmEREB46具有典型的AP2/EREBP结构域，属于AP2/EREBP类基因家族。AP2/EREBP类基因家族是植物逆境胁迫相关的重要基因。玉米中，ZmEREB180除了能促进植株不定根的生成外，还能通过增强植株抗氧化剂的生成来提高玉米渍水胁迫下的生存能
在转录因子的启动子序列中，包含有多种不同类型的顺式作用元件，针对转录因子的启动子序列进行分析，对阐明其分子作用机制具有重要意义。玉米中，作为ERF家族成员的ZmERF5被鉴定为一个受到渍水胁迫诱导的基因，在耐渍自交系HZ32以及渍水敏感自交系Mo17中对其启动子进行测序分析，发现其启动子序列中含有多个厌氧响应顺式元件和激素响应元
转座因子（transposable element， TEs）是基因组DNA序列中的可移动因子。转座子在植物的适应性进化和表型变异中发挥重要作用，包括产生等位基因多样性、诱导结构变异和调控基因表
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