摘要
为探索囊胚孵化发育中关键基因的表达规律、进一步解析妊娠识别机制，以小鼠囊胚为模型，对孵化进程中不同时期的囊胚进行转录组分析，并对关键基因表达量进行qPCR检测，对关键蛋白表达模式进行免疫荧光染色。转录组分析发现小鼠囊胚从扩张、孵化到完成孵化的孵化过程，差异基因表达呈2种调控模式，对调控模式中的基因集进行GO分析、KEGG分析，发现涉及免疫与炎症、细胞分化、凋亡过程等生物过程。qPCR结果显示Ptgs1、Lyz2、Il⁃1α、Cfb、Ccl9表达上调，Cd36表达下调，结果与转录组分析一致。免疫荧光染色分析发现Plac1、Cdx2、C3在小鼠囊胚孵化过程中表达下调，Lyz2、Il⁃1β则表达上调。以上研究结果表明小鼠囊胚在孵化进程中，基因表达呈特定的分化动态，异常基因表达将导致孵化停滞。
哺乳动物胚胎发育从受精开始，经过一系列细胞增殖和分化，最终形成一个由滋养外胚层（trophectoderm，TE）围绕内细胞团（inner cell mass，ICM）的空腔结构，即囊胚。随着囊胚腔的不断扩大，胚胎从透明带中孵化出来与子宫内膜接触，开始胚胎植入和妊娠，从而在子宫内发育成完整个
孵化对哺乳动物囊胚的着床至关重要，任何影响囊胚孵化的不良因素都可能会引起胚胎着床失
本研究所用5~7周龄雌鼠和8周龄ICR雄鼠来源于新疆医科大学实验动物中心。小鼠饲养在规范的鼠房中［温度（23±2） ℃，湿度（25±3）%，开关灯时间间隔为12 h］。动物实验遵照新疆大学动物实验与实验动物福利相关规范（XJUAE-2022-07）实施。
试剂：孕马血清促性腺激素（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）购自宁波激素二厂；胎牛血清（FBS）购自HyClone；磷酸缓冲盐溶液（PBS）、KSOM胚胎培养液、多聚甲醛固定液（PFA）、聚乙烯醇（PVA）和石蜡油购自SIGMA；细胞核荧光染料（DAPI）、兔抗（Lyz2、C3、Cdx2、Il-1β、Plac1）和羊抗兔（AF488）购自Abcam公司；反转录试剂盒和qPCR试剂盒购自Abm公司。
仪器：电子天平（DENYER）、CO2胚胎培养箱（Thermo Forma）、超净台（AIRTECH）、体视显微镜（Motic）、恒温台（BYA）、PCR仪、实时荧光定量PCR仪（Applied biosystems）、激光扫描共聚焦显微镜（Nikon）、35 mm培养皿（BIOFIL）、一次性注射针和玻璃毛细管（1.5 mm外径）。
育龄雌鼠经腹腔注射PMSG 7.5 U，46~48 h后腹腔注射HCG 7.5 U。与雄鼠合笼，次日检查阴栓，若阳性，则标记妊娠0.5 dpc，待72 h后，脱颈处死后解剖孕鼠获取子宫，吸取M2培养液，冲出位于子宫的囊胚，清洗完毕后，移入提前平衡好的KSOM培养液微滴中，放置于37 ℃恒温培养箱中进行培养。雌鼠超数排卵数量依照实际情况而定。
在培养前4~6 h或提前1 d制作KSOM培养滴，覆盖石蜡油置于37 ℃恒温培养箱中平衡CO2。在培养液中发育最好的胚胎/孵育液比例约是1个胚胎/2 μL培养液。由于胚胎对pH及温度波动非常敏感，所以尽量减少小鼠囊胚在空气中的暴露时间。将所取囊胚放入恒温箱中培养，及时查看囊胚发育状况，及时更换液滴继续培养。
根据Gardner分级，对3.5 dpc的囊胚进行分级后统计。Ⅰ级：早期囊胚，囊胚腔体积＜囊胚总体积的1/2；Ⅱ级：囊胚腔体积＞囊胚总体积的1/2；Ⅲ级：完全扩张囊胚，囊胚腔占据整个囊胚；Ⅳ级：扩张后囊胚，囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄；Ⅴ级：正在孵化的囊胚，囊胚正在从透明带破裂口孵出；Ⅵ级：孵化出的囊胚，囊胚完全从透明带中脱出。
小鼠囊胚在KSOM中孵育暂存，培养6~12 h后可选出孵化前（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级囊胚）、孵化中（Ⅴ级囊胚）、孵化完成（Ⅵ级囊胚）和到期孵化停滞囊胚共4组。将4组囊胚分别进行反转录、qPCR及免疫荧光染色试验。
从6只雌鼠体内取出囊胚共150枚，将囊胚在KSOM培养液中培养直至孵化，每个时期选取5枚囊胚，共计20枚胚胎。每个时期胚胎裂解后反转录得到cDNA。每5枚囊胚可反转录得到120 μL cDNA，每个时期验证10个基因，每个基因3个重复。
首先使用试剂盒合成cDNA，对不同时期的囊胚分别进行裂解、RNA提取及反转录，反转录获得的cDNA放入-20 ℃储存供qPCR使用。先前通过转录组分析已经筛选出了10个关键基因（Cd36、Ccl9、C3、Cyp17al、IL-1a、Ccl5、Susd4、Cfb、Ptgs1、Lyz2），设计qPCR扩增引物。使用看家基因Gapdh作为内参，以各个时期的cDNA作为模板，利用对应的引物PCR扩增目的片段。反应体系：20 μL反应体积，含10 μL BlasTaq 2×qPCR Master Mix，上游、下游引物各0.5 μL，2 μL cDNA。扩增反应条件为：95 ℃，1 min，1个循环；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；45个循环。扩增产物4 ℃保存。扩增产物在含核酸染料的质量分数为2%琼脂糖凝胶、1×TAE缓冲液中电泳20 min，检测扩增条带。跑胶完成后在凝胶成像仪中成像。对扩增产物的荧光信号达到设定荧光阈值对应的扩增循环数（CT值）按照Livak法进行分析处理，可定量反映扩增产物的浓度。
选取每个时期的囊胚30枚，分为6个检测组（control、C3、Cdx2、Il-1β、Lyz2、Plac1），每组5枚囊胚，分别进行免疫荧光染色。一抗染不同的抗体（C3、Cdx2、Il-1β、Lyz2、Plac1），control组不染一抗；二抗均染相同的抗体AF488。
首先将特定时期的囊胚在0.1% PVA中洗3遍，每遍3~5 min，洗去囊胚表面的KSOM及石蜡油。在4% PFA缓冲液中固定20 min，继续用0.1% PVA洗3遍。在室温下用含0.5% Triton X-100的PBS透化15 min，0.1% PVA洗3遍，每遍10 min。随后用4% PBS常温封闭1 h或在37 ℃恒温箱中封闭30 min。随后分组并分别在2% PBS稀释过的一抗（control组在PVA）中于37 ℃恒温箱中孵育1 h或者4 ℃过夜。用0.1% PVA洗3遍后，将囊胚在相应二抗中避光、37 ℃孵育1 h。孵育结束用0.1% PVA洗3遍，将囊胚移入DAPI中染色5 min，再次移入0.1% PVA中，使用激光扫描共聚焦显微镜对样品进行成像。对拍摄的照片进行荧光强度分析，采用平均灰度值（mean±SEM）评价囊胚孵化过程中的分子蛋白表达水平。
分别对孵化前囊胚（E）、A位点孵化囊胚（A-site）、B位点孵化囊胚（B-site）、C位点孵化囊胚（C-site）、孵化后囊胚（H）和孵化停滞囊胚（N）进行RNA-Seq测序。通过转录组分析发现，在孵化进程中的每个进程囊胚基因表达呈一致的相关性聚类，且呈现规律化的转变；完全孵化的囊胚和孵化前囊胚各自分为不同的2类（
图1 转录组样本聚类分析
Fig. 1 Transcriptome sample cluster analysis
对出生率相差最大的B-site、C-site孵化囊胚差异基因进行分析，发现共有178个基因转录表达差异显著（P<0.05），其中75个基因表达上调，103个基因表达下调（
图2 B、C位点差异基因分析柱状图
Fig. 2 Histogram of differential gene analysis at B and C cite
*：P<0.05.
通过对E、B-site、C-site、N囊胚差异基因韦恩图分析，发现471个基因的表达与囊胚的孵化有相关性（
图3 差异基因表达趋势分析
Fig. 3 Trend analysis of differential gene expression
A： B、C位点差异基因韦恩图；B：差异基因趋势图。A：Venn map of differential genes at sites B and C； B： Trend map of differential genes.
对分化模式中的差异基因进行GO分析，富集的前10个信号通路中主要是免疫与炎症相关通路（
图4 GO富集条形图
Fig.4 GO enrichment bar chart
KEGG分析中富集的前10个信号通路主要包括病毒感染、细胞因子与受体互作、信号的调控转录等相关信号通路，这些信号通路都与先天免疫相关，表明囊胚发育过程中免疫学特征发生转变（
图5 KEGG分析显著性气泡图
Fig.5 KEGG analyzed significant bubble maps
qPCR扩增结果发现，在小鼠囊胚孵化过程中，Ptgs1、Lyz2、Il⁃α、Cfb、Ccl9基因表达上调，Cd36基因表达下调，Ccl5、C3、Cyp17al、Ptgs1处于较低表达水平或相对表达量为0（
图6 关键差异基因在胚胎孵化进程中的表达
Fig. 6 Expression of key differential genes during embryo hatching
通过对免疫荧光的平均灰度值进行分析，数据显示C3、Cdx2、Il⁃1β、Lyz2、Plac1在囊胚中均呈现阳性表达，control组没有绿色荧光，证明试验结果可靠。不同分子在小鼠囊胚中表达模式不同，但同一基因在不同时期的表达模式相同（
图7 免疫荧光染色检测关键基因在胚胎孵化中的蛋白表达
Fig.7 The protein expression of key genes during embryo hatching detected using immunofluorescence staining
图8 关键分子在孵化过程的蛋白表达分化趋势
Fig.8 Differential trends in protein expression of key molecules during incubation
囊胚的植入是成功妊娠的关键，胚胎通过侵入母体子宫组织获取其生存和发育所必需的营养物质。植入是一个持续变化的动态和交互的过程，需要囊胚和子宫内膜之间精细的双向通讯，包括免疫细胞、细胞因子、生长因子、趋化因子和黏附分子等方面的细胞和分子互
研究表明母体免疫系统对胚胎植入有积极贡献，胚胎信号被母体免疫细胞识别以诱导免疫耐受，通过激活炎症和免疫变化来诱导子宫内膜分化并促进胚胎着床，从而促进子宫内膜容受
参与胚胎着床的相关分子之间的调控是相当复杂的，不同时期的特定基因表达介导特定的分子事件，涉及多种基因、细胞因子及信号转导通路的调
囊胚孵化的过程是一群不同的基因有规律地变化的过程，体现在相关基因的趋势变化，差异基因呈现聚类表达。囊胚孵化过程中会发生一系列分子事件，其中的关键分子在群体和个体中均出现差异化表达。本研究通过对特定孵化时期的多枚小鼠囊胚进行试验，明确关键基因在小鼠孵化过程中的特异表达，可作为解析囊胚着床发育分化命运的检测目标分子，筛选出的目的基因可以作为胚胎质量预测及鉴定的关键分子，可为解析囊胚着床发育分化提供可靠的数据支撑。解析胚胎信号以进一步阐明免疫控制机制，将有助于有效开展临床生殖障碍免疫治疗，最大限度减少植入失败。
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