摘要
为解析玉米籽粒形成的遗传基础，探究Emp35基因在玉米籽粒发育中的作用，对籽粒缺陷突变体empty pericarp35（emp35）进行表型鉴定、胚乳细胞显微观察、胚乳贮藏物质含量测定及图位克隆。结果显示：突变体籽粒发育缓慢，明显小于同期发育的正常籽粒，成熟籽粒干瘪呈空皮状；胚乳细胞显微观察发现emp35的胚和胚乳发育严重滞后，胚乳细胞中线粒体结构异常；淀粉和蛋白质积累减少；F2代分离果穗上正常籽粒与发育缺陷籽粒呈3∶1分离，表明籽粒缺陷表型由单个隐性核基因突变所致。采用集团分离分析法（bulked segregant analysis， BSA） 将Emp35定位于第8染色体 127.90~163.36 Mb区间，在该区间内开发了4个InDel标记，连锁作图将Emp35精细定位于139 571 117~146 176 858区间。
玉米籽粒产量由单位面积穗数、每穗粒数和籽粒质量3个因素构成。籽粒质量由籽粒库容和胚乳充实程度所决
胚是玉米授粉后籽粒中最早开始发育的器官，也是决定种子发育的关键组织。胚发育缺陷突变体主要涉及能量供应和重要蛋白质合成相关功能，如Lem1和Emb14控制质体核糖体的形成与组
本研究以1个从γ射线诱变B73的突变体库中筛选得到的空种皮（empty pericarp， emp）籽粒表型突变体emp35为材料，分析该突变体籽粒中胚和胚乳的动态发育和主要贮藏物质的含量变化，并开展Emp35基因定位，以期从发育生物学和遗传学角度解析突变体的籽粒表型，进而全面解析籽粒质量形成的遗传基础，为玉米籽粒质量的遗传改良提供科学依据。
本研究所用的emp35突变体由长江大学杜何为教授提供。将B73种子经γ射线诱变处理后种植于大田，植株自交。突变体emp35是从自交果穗中分离出来的籽粒发育缺陷突变体。由于纯合emp35/emp35无法繁殖，以emp35杂合体植株（+/emp35）自交繁殖保存突变体基因型。通过+/emp35与Mo17杂交，然后自交，选择表型分离的自交果穗用于遗传分析和基因定位。
种植+/emp35杂合单株，授粉后分别选取授粉后10、12、14、18 d 自交果穗上的幼嫩籽粒，纵向分割，保留籽粒中部厚2~3 mm的组织用于包埋。石蜡包埋、染色以及切片参考Ren
取授粉后9、14 d的幼嫩籽粒，从籽粒中部靠近顶端的位置进行横切，切片厚约2 mm，浸泡于2.5%戊二醛中固定。扫描电镜制样参照文献［
取授粉后10 d的野生型和突变体籽粒，从籽粒上部取微量胚乳组织固定于2.5%戊二醛溶液中。透射电镜制样参考Cai
收获+/emp35自交成熟果穗，选取21个正常发育且籽粒数目较多的果穗，统计干瘪皱缩籽粒和饱满圆润籽粒数，计算野生型籽粒与突变籽粒的分离比，进行
从+/emp35植株自交果穗上随机挑选野生型和突变体成熟籽粒，使用淀粉测定试剂盒（K-TSTA-100A/K， Megazyme， Ireland） 提取并测定玉米籽粒总淀粉含量，3次生物学重复，每个生物学重复包括3次技术重复。具体步骤见操作手册。
采用硼酸钠浸取法提取籽粒总蛋白质，再用无水乙醇萃取总蛋白溶液分离醇溶蛋白和非醇溶蛋
将+/emp35单株与Mo17杂交获得F1，F1单株分别自交，选取籽粒表型发生分离的授粉后14 d的果穗。在果穗上挑选30粒正常籽粒和30粒发育缺陷籽粒，分别混合构建野生型池（bulk-WT， Bwt）和突变型池（bulk-Mut， Bmt）。采用CTAB法提取基因组DN
对于测序原始数据，首先使用Cutadapt
完成变异检测后，分别计算Bwt和Bmt基因组上各变异位点的突变reads与总reads的比值，即SNP-index。再计算SNP-index （WT）与SNP-index （Mut）的差值，即Δ（SNP-index）。Δ（SNP-index）值高于阈值（在P<0.01水平下进行10 000次计算）的基因区间即可认为可能为目的基因所在区段。
根据上述分析结果，选择目标基因区间在B73和Mo17、Bwt和Bmt之间的InDel变异，进一步将B73序列与Mo17参考基因组（http：//maize.plantbiology.msu.edu/）进行比对，确定InDel变异的真实性，并设计InDel标记引物（
引物名 Primer name | 物理位置 Position | 正向引物(5'→3') Forward primer | 反向引物(5'→3') Reverse primer |
|---|---|---|---|
| ID128 | 128 194 772 | TGGTCTGTCTTCTCACGCCTC | CACCTCCGACATGCACGCGA |
| ID134 | 134 506 973 | CCAAACGTGAATCCAGACAG | GACGTTGCGCTTCACTATGG |
|
ID140 ID146 |
139 571 147 146 176 858 |
ATACAGTCCACTTGTGAGAG CGCTAGAATCTACACGATGG |
TCTGGATACAGACAGACTTG CCTGCTTTCAGGAGAGAAGG |
从γ射线诱变B73的突变体库中筛选到1个籽粒发育缺陷突变体，突变体籽粒干瘪，只有空种皮，没有或只有少量内容物，命名为empty pericarp 35 （emp35）， 该突变体只能以杂合体形式保存。选取+/emp35杂合体植株自花授粉后不同时间的果穗，观察籽粒发育的动态变化。授粉后12 d，籽粒颜色都为乳白色，野生型和突变体籽粒大小已有区别，突变体种皮皱缩（
图1 野生型和突变体的籽粒表型
Fig.1 Phenotypes of wild-type and mutant kernels
A： 授粉后12 d的分离果穗表型。B： 授粉后18 d的分离果穗表型。C： 野生型与突变体籽粒。D： 具有野生型和突变体籽粒分离的成熟果穗。箭头指示突变体籽粒。标尺= 1 cm。A： Developing ear 12 days after pollination with wild-type and mutant kernel segregation. B： Developing ear 18 days after pollination with wild-type and mutant kernel segregation. C： Wild-type and mutant kernels. D： Mature ear with wild-type and mutant kernel segregation. Arrows indicates mutant kernels. Scale bar = 1 cm.
从不同发育时期的+/emp35自交果穗上，选取野生型和突变体籽粒进行石蜡切片和显微观察。授粉后10和12 d野生型籽粒胚分化产生胚芽鞘，胚乳细胞分化、数目多且分布致密 （
图2 野生型和突变体籽粒发育进程的细胞学观察
Fig.2 Cytological observation of the development processes of wild-type and mutant kernels
A-D：分别为授粉后10、12、14、18 d的野生型籽粒；E-H：分别为授粉后10、12、14、18 d的突变体籽粒；I， K：授粉后12 d的野生型（I）和突变体（K）籽粒的基底胚乳传递层； J， L：授粉后15 d野生型（J）和突变体（L）籽粒的基底胚乳传递层。en：胚乳；em：胚；BETL：基底胚乳传递层；标尺=1 mm。A-D： Wild-type kernels of 10，12，14，18 days after pollination. E-H： Mutant kernels of 10，12，14，18 days after pollination. I， K： The basal endosperm transfer layers of 12 days after pollination wily-type （I） and mutant （K） kernels. J， L： The basal endosperm transfer layers of 15 days after pollination wily-type （J） and mutant （L） kernels. en：Endosperm； em：Embryo； BETL：Basal endosperm transfer layer. Scale bar＝1 mm.
BETL是营养物质从母体向籽粒运输的组织。显微观察发现，授粉后12和15 d野生型籽粒已形成成熟的BETL细胞和多层的传递层细胞，BETL细胞沿垂直方向伸长，次生细胞壁向胞内交错生长（
扫描电子显微镜观察发现，授粉后9 d的野生型籽粒胚乳细胞中已有较多成熟淀粉粒，淀粉粒分布集中 （
图3 野生型和突变体籽粒胚乳细胞的扫描电镜及透射电镜观察
Fig.3 Scanning electron microscopic and transmission electron microscopic observation of wild-type and mutant endosperms
A， C： 授粉后9 d的野生型（A）和突变体（C）胚乳中的淀粉粒；B，D：授粉后15 d的野生型（B）和突变体（D）胚乳中的淀粉粒；箭头指示淀粉粒；E：授粉后10 d的野生型胚乳细胞中的线粒体；F：授粉后10 d的突变体胚乳细胞中的线粒体。mt：线粒体；cw：细胞壁；pb：蛋白体。A， C： Starch grains in endosperms of 9 days after pollination wily-type （A） and mutant （C） kernels；B， D： Starch grains in endosperms of 15 days after pollination wily-type （B） and mutant （D） kernels；Arrows point out starch grains；E： Mitochondria in wild-type endosperm cells from developing kernel 10 days after pollination；F： Mitochondria in mutant endosperm cells from developing kernel 10 days after pollination. mt：Mitochondria； cw： Cell wall； pb： Protein body.
通过透射电子显微镜观察发现，授粉后10 d 野生型胚乳细胞中的线粒体形态完整，线粒体内膜堆积排列规律整齐、内嵴清晰可见、无明显空泡（
胚乳细胞中淀粉和蛋白质定量检测结果显示，平均每颗野生型籽粒中胚乳淀粉含量占胚乳干物质的72.17%，而平均每颗emp35籽粒中胚乳淀粉含量则仅占胚乳干物质比的6.72%（
图4 emp35籽粒中的淀粉和蛋白质含量
Fig. 4 Starch and protein content in wily-type and mutant kernels
A： 野生型与突变体籽粒胚乳淀粉含量占胚乳干物质的比；B： 野生型和突变体籽粒中总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的含量。***： P <0.001。A： The proportion of starch content to dry matter in endosperm of wild-type and mutant kernels. B： The contents of total protein， zein， and non zein of wild-type and mutant kernels. ***： P <0.001.
野生型和突变体籽粒中总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的含量测定结果显示，emp35籽粒总蛋白占籽粒质量的2.29%，显著低于野生型籽粒的13.30%（P<0.001）（
以+/emp35杂合植株与Mo17杂交，F1代植株自交，部分F2植株上的果穗存在正常籽粒与干瘪籽粒的分离。在21个分离果穗中，共有野生型籽粒4 675粒、突变体籽粒1 545粒，野生型与突变型分离比= 3.02∶1。
从表型分离的果穗上分别挑选30粒野生型和30粒突变体籽粒，构建野生型（Bwt）和突变体（Bmt）混池，对亲本B73和Mo17及混池进行重测序，结果显示，B73与Mo17分别获得422 989 871和377 327 339个reads，分别可覆盖参考基因组的95.03%和79.90%，覆盖深度达36.87×和30.76×。Bwt和Bmt混池则分别获得330 257 568和270 665 372个reads，可覆盖B73参考基因组的90.90%和90.03%，覆盖深度为25.82×和21.67×。将所有样品的reads序列比对到B73参考基因组上，在2个混池间共筛选到5 114 337个SNP位点和681 377个InDel 位点。使用Δ（SNP-index）值进行候选基因定位，Δ（SNP-index）值超过设定阈值的reads集中在玉米第8号染色体上127.90~163.26 Mb的物理区间内，该区间的物理距离为35.36 Mb（
图5 Δ（SNP index）值及SNP/InDel在各染色体上的分布
Fig.5 Distribution of the Δ（SNP index） and SNP/InDel’s on maize chromosomes
A： Δ（SNP index）值在各染色体上的分布，横坐标数字代表玉米的染色体编号，箭头表示Δ（SNP-index）超过阈值的区域。B： SNP 和 InDel 在染色体上的分布。纵坐标数字分别代表玉米的染色体编号及测序片段数量，红框表示初定位区间内测序数据量少、核苷酸变异少的区段。A： Distribution of Δ（SNP index） on maize chromosomes. The numbers on the x-axis represents the chromosome number of maize， arrow represents for the region where the value of Δ（SNP-index） exceeds the threshold. B： Distribution of SNPs and indels on chromosome. The numbers on the y-axis represent the chromosome number and of maize and the number of reads. Red frame represents for the interval with small numbers of reads and small numbers of nucleotide variation within the initial localization interval.
BSA-seq分析结果显示，第8染色体146~163 Mb区间测序数据量低、核苷酸变异少，难以开发多态性标记（
图6 128~146 Mb区间的分子标记遗传连锁图
Fig.6 Molecular marker genetic linkage map in 128 to 146 Mb interval
4个InDel标记基因型及籽粒表现型构建的遗传连锁图（ID128、ID134、ID140 和ID146）。Genetic linkage map is constructed by 4 molecular markers （ID128， ID134， ID140 and ID146）.
玉米籽粒发育是决定产量的重要因素，而玉米籽粒发育缺陷突变体是研究籽粒发育机制的重要资源。空种皮突变体是一类胚和胚乳发育异常、籽粒皱缩、种子败育，对产量产生极大影响的籽粒发育缺陷突变体。已克隆的Emp基因大多数为编码35肽重复蛋白家族 （pentatricopepetide repeat protein， PPR）。PPR蛋白家族是一类由多个串联重复基序组成的蛋白质，重复数为2~30，每个基序由35个低保守度的氨基酸组
本研究中，F2群体的遗传分析表明，emp35的突变表型是由单个核基因隐性突变所致。通过BSA-seq将Emp35基因定位在8号染色体上127.90~163.26 Mb的区间内。用4个InDel标记分析F2群体中的突变体表型籽粒的基因型并作出遗传连锁图，将Emp35精细定位于139 571 147~146 176 858区间内。目前该定位区间内没有已克隆的玉米籽粒发育基因，表明Emp35是一个新发现的籽粒发育相关基因。在后续研究中，将开展Emp35的精细定位与基因克隆，探究Emp35基因的表达部位，研究线粒体基因的转录翻译过程以验证Emp35突变基因对线粒体合成的影响，解析Emp35基因在籽粒发育过程中的生理功能及作用机制，为玉米籽粒质量的改良与稳产品种的选育提供理论依据。
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