摘要
为探究外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）对米尔伊丽莎白菌致病作用的影响，以蛙源米尔伊丽莎白菌FL160902为研究对象，通过同源重组法构建OmpA缺失株△ompA，比较缺失株和野生株的生长特性、生物膜形成能力、抗血清杀伤能力、对细胞的黏附能力以及对蛙的致病性差异。结果显示：△ompA的生长能力和抗血清杀伤能力与野生株无显著差异；但与野生株相比，△ompA的生物膜形成能力增加了66%，△ompA对bEnd.3细胞的黏附能力降低了61%；黑斑蛙感染试验显示，△ompA在黑斑蛙血液、脾和脑组织中的载菌量分别为（3.15×1
牛蛙（Rana catesbeiana）、棘胸蛙（Quasipaa spinosa）、黑斑蛙（Pelophylax nigromaculata）等蛙类在我国分布比较广泛，因其肉质鲜美、营养丰富、经济价值高，我国于20世纪80年代开始了人工养
米尔伊丽莎白菌是一种革兰氏阴性短杆菌，隶属于黄杆菌目（Flavobacteriales）、威克斯氏菌科（Weeksellaceae）、伊丽莎白菌属（Elizabethkingia
外膜蛋白A（outer membrane protein A， OmpA）是革兰氏阴性菌外膜蛋白的重要组成成分，参与维持细菌结构的完整
米尔伊丽莎白菌FL160902株为本研究所用野生型菌株（wild type strain，WT
细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒中提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；PCR产物回收试剂盒购自美国Omage公司；2×A8 FastHiFi PCR MasterMix购自北京艾德莱生物科技有限公司；限制性内切酶SacⅠ、XbaⅠ和DNA marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；Uniclone One Step Seamless Cloning Kit购自北京金沙生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）和DMEM培养基购自Gibco公司；氨苄青霉素（Amp）、壮观霉素（Spc）、氯霉素（Cm），均购自Biosharp公司；脑心浸液培养基（BHI）购自美国OXOID公司；琼脂粉购自德国Biofroxx公司。引物（
| 引物名称Primers | 序列（5'-3'） Sequence |
|---|---|
| ompA-left-F | CATGAATTCCCGGGAGAGCTCCATTCCGGTTGCAGCTGTT |
| ompA-left-R | CAGAAGACGGCATACGAACTCCTGAGCTGTTGATAC |
| ompA-right-F | AGAGTAGGGAACTGCCAGGCGAAGAACAGAAGGGTAG |
| ompA-right-R | CGATCCCAAGCTTCTTCTAGAATCAAATCCTGGGAACTGC |
| ompA-F | GTTTCCTTACCTGAATCCG |
| ompA-R | GCAGCCAAAGGATTATCC |
| ompA-check-F | TCTGAACGATATATGCC |
| ompA-check-R | GAAATCGGTATAGCAACG |
| Spc-F | TTCGTATGCCGTCTTCTG |
| Spc-R | CTGGCAGTTCCCTACTCT |
| ureG-F | TCTGGAAAACGTGCTGCTAA |
| ureG-R | TGTGGGTTCTGGTAAAACTGC |
| PNGase F-F | GACAGGATCTGGGTCTGGTA |
| PNGase F-R | CTTTGGCTGCTTCCTTCC |
参照文献［
将野生株和△ompA接种于BHI液体培养基中，37 ℃ 200 r/min震荡培养过夜，调整各菌液OD600为0.8左右，菌液以1∶100接种至BHI液体培养基，涡旋混匀细菌悬浮液，取200 μL细菌悬浮液加入到灭菌的96孔板中，用微生物生长曲线全自动检测系统FLUOstar Omega测定，设置程序：温度37 ℃，连续振荡，每1 h测定1次OD600，连续培养24 h。每个样品3个平行，试验独立重复3次。
参照文献［
参照文献［
参照文献［
试验所用黑斑蛙购自湖北省潜江市黑斑蛙养殖基地，黑斑蛙个体质量为（30±0.5） g，暂养于华中农业大学淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心。暂养1周后开始人工感染试验，用野生株和△ompA感染黑斑蛙后，分别测定黑斑蛙的组织载菌量和存活率。组织载菌量测定试验共3组，分别为野生株组、△ompA组和对照组PBS组，每组15只蛙，攻毒途径为下肢肌肉注射，攻毒所用各菌液浓度均为1×1
如
图1 缺失株△ompA的PCR鉴定
Fig.1 Identification of the ompA mutant strain by PCR
M：DL2 000 DNA marker；1、3、5、7：缺失株扩增产物；2、4、6、8：野生株扩增产物；1~2：ompA基因内部引物ompA-F/R验证；3~4：Spc基因引物Spc-F/R验证；5~6：ompA基因外部引物ompA-check-F/R验证；7~8：米尔伊丽莎白菌双重PCR鉴定。M：DL2 000 DNA marker； 1， 3， 5， 7：Amplified products of the mutant； 2， 4， 6， 8：Amplified products of wild-type strain； 1-2：Primers of ompA-F/R； 3-4：Primers of Spc-F/R； 5-6：Primers of ompA-check-F/R； 7-8： Primers of duplex PCR of E. miricola.
如
图2 野生株和缺失株△ompA的生长曲线
Fig.2 Growth curve of the wild-type strain and mutant strain ΔompA
通过结晶紫染色法测定米尔伊丽莎白菌生物膜的形成量，OD值代表乙醇脱色液的吸光值，OD值越高，表明被结晶紫染色的生物膜含量越高。由
图3 野生株和缺失株△ompA的生物膜形成能力
Fig.3 Biofilm formation capacities of the wild-type strain and mutant strain △ompA
***：P<0.001.
如
图4 野生株和缺失株△ompA在50%血清中的存活能力
Fig.4 Survival rate of the wild-type strain and mutant strain △ompA in 50% serum
如
图5 野生株和缺失株△ompA黏附bEnd.3细胞能力
Fig.5 Adherence abilities of the wild-type strain and mutant strain △ompA
**：P<0.01.
用野生株和△ompA感染黑斑蛙，检测黑斑蛙的组织载菌量和存活率。结果如
图6 感染后黑斑蛙血液（A）、脾（B）和脑组织（C）中载菌量
Fig.6 Bacterial loads in blood （A）， spleen （B） and brain （C） of infected frogs
*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001.
图7 黑斑蛙感染野生株和缺失株△ompA后的存活率
Fig.7 Survival rate of frogs infected with the wild-type strain and mutant strain △ompA
*：P<0.05.
本研究成功构建了蛙源米尔伊丽莎白菌OmpA缺失株△ompA，并基于此初步探究了OmpA在米尔伊丽莎白菌致病性中的功能。我们发现OmpA不影响米尔伊丽莎白菌的生长特性，排除菌株生长特性差异对后续OmpA致病功能研究结果的影响。
米尔伊丽莎白菌能形成生物膜，附着在基质的表面，帮助细菌抵抗抗菌药物和宿主免疫杀伤，是该菌存活力和致病性的重要体
米尔伊丽莎白菌黏附宿主细胞是引发感染的第一步，也是该菌定殖机体，从而发挥其致病作用的前
我们通过黑斑蛙感染模型进一步评估了OmpA对米尔伊丽莎白菌致病力的影响。结果显示，野生株和△ompA感染黑斑蛙后，△ompA在黑斑蛙血液、脾、脑组织中的载菌量较野生株显著下降，且△ompA对黑斑蛙的致死率显著低于野生株，这表明在米尔伊丽莎白菌致病过程中，ompA基因缺失降低了该菌在宿主体内的定殖能力，导致该菌致病性减弱。本研究结果与副溶血弧菌中OmpA的研究结果类似，在副溶血弧菌中，ompA基因缺失株在小鼠各脏器中的定殖能力下降，且对小鼠的致死率显著降
综上，本研究初步探究了OmpA在米尔伊丽莎白菌致病性中的功能，发现OmpA负调控米尔伊丽莎白菌的生物膜形成，不改变细菌的抗血清杀伤能力，但是参与调控了细菌的黏附能力，影响了其致病性，表明OmpA为米尔伊丽莎白菌重要的毒力因子，这是目前该菌中首个被验证的毒力因子，本研究结果可为米尔伊丽莎白菌致病机制的研究及“歪头病”防控策略的制定提供新的思路。
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