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黄颡鱼硒蛋白基因的克隆与分析  PDF

  • 刘光辉 1 ✉
  • 余岸艮 1
  • 何杨 1
  • 郭雨诗 1
  • 柯江 1
  • 罗智 1,2,3 ✉
1. 华中农业大学水产学院,武汉430070； 2. 华中农业大学深圳营养与健康研究院,武汉430070； 3. 中国农业科学院深圳农业基因组研究所/岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心,深圳 518000

中图分类号： Q959.4

最近更新：2024-01-30

DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2024.01.021

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EN 引
目录contents

摘要

为探讨黄颡鱼硒蛋白selenow2a、selenop2和selenot2基因之间的关系，采用3′/5′ RACE PCR克隆得到3个基因的cDNA全长，分别为891、1 998和1 432 bp，其中ORF长度分别为288、828和600 bp，编码95、275和219个氨基酸。在线工具SECISerach3对3个基因的cDNA序列分析结果显示，它们都含有可以编码硒代半胱氨酸的终止密码子，以及在3′非编码区存在SECIS元件。通过氨基酸序列比对和系统发育树分析，发现selenow2a、selenop2和selenot2基因预测得到的氨基酸序列与斑马鱼（Danio rerio）氨基酸相似性分别为82.24%、66.19%和79.45%，而与斑点叉尾鮰（Ictalurus punetaus）的氨基酸相似性分别为94.74%、68.50%和90.95%，在发育树上则显示为树杈相接近。采用实时荧光定量PCR检测3个硒蛋白基因的mRNA在黄颡鱼心脏、肝脏、肌肉、脑、肠、脾脏、精巢和卵巢组织中的表达，结果显示其mRNA表达水平呈现组织特异性。表明3个基因拥有硒蛋白家族的特征，但在组织表达上具有特异性。

硒（selenium）是脊椎动物维持细胞功能的正常行使并参与多种代谢活动必需的微量元素之一［

1-2］。体内过高或过低的硒水平会引起水产动物机体免疫力［3］、生长性能［4］的降低以及硒毒性［5］等负面影响。因此，在水产饲料中添加适量的硒用于保持鱼体健康成长是必需的［6］。

硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec） 是细胞中硒的主要形式，于 20 世纪 70 年末被发现且被归于第21种氨基酸，由终止密码子UGA编码，并通过特殊的共翻译机制嵌入到多肽链中。硒蛋白是含有Sec的蛋白，也是硒参与体内生理调控的关键生物分子，其特征是至少含有1个Sec，Sec的存在使得硒蛋白能够参与氧化还原反应。至今，在小鼠和人类中分别发现了24种和25种硒蛋白［

7］。通常情况下，UGA密码子在翻译中执行终止信号。然而，当硒半胱氨酸插入序列（selenocysteine insertion sequence，SECIS）出现在3′非翻译区（3′ untranslated region，3′ UTR）时，UGA会被翻译成Sec［8］。

在斑马鱼中已经鉴定18个含Sec的硒蛋白基因［

9］，此外，部分硒蛋白基因也在其他鱼类中被发现。例如，在蓝鳍金枪鱼（Thunnus maccoyii）和光唇鱼（Acrossocheilus fasciatus）发现硒蛋白gpx1基因［10-11］；在鲤（Cyprinus carpio）和蓝鳍金枪鱼得到了gpx4基因的信息［10，12］。硒蛋白基因selenou、selenow和selenop的信息也分别在河豚（Tetraodontidae）、鲫（Carassius auratus）和罗非鱼（Oreochromis niloticus）中获得［13-15］。最近，笔者所在实验室已经在黄颡鱼中克隆获得了7种硒蛋白（gpx1、gpx3、gpx4、selenow、selenop、txnrd2和txnrd3）基因的信息，并描述了这些硒蛋白基因的分子特征［16］。在此基础上，本研究克隆获得黄颡鱼3个硒蛋白基因（selenow2a、selenop2和selenot2）的全长cDNA序列，使用生物信息学等方法分析其氨基酸序列同源性、结构域和进化关系，并探讨了它们的组织表达分布，以期为深入了解硒蛋白基因之间的结构和功能的异同及它们在生物进化上的联系提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验鱼及试剂

试验用鱼购自武汉市当地农贸市场。在不投喂处理24 h后，选取健康、体形一致的体质量为（24.2±2.4） g的黄颡鱼分2组进行采样分析：第1组黄颡鱼取肝脏和卵巢组织用于基因cDNA克隆。第2组黄颡鱼样品用于测试心脏、肝脏、脑、脾脏、肌肉、精巢、卵巢和肠组织中黄颡鱼基因的表达水平。取样方法参照Zhao等［

17］方法，所有样品的获取均在冰上进行，样品总RNA的分离和提取在取样后迅速进行，于-80 ℃保存样品和RNA提取物。

凝胶回收试剂盒（Omega）、TRIzol试剂、逆转录试剂盒、3′/5′RACE PCR试剂盒、RT-PCR试剂盒，均购自TaKaRa公司；RNA提取实验中用到的异丙醇、乙醇等化学试剂均为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 硒蛋白基因cDNA序列的克隆

序列克隆参照文献［

17］的研究方案进行。总RNA的提取按照TRIzol说明书进行。使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop ND 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，USA）检测总RNA的质量和浓度，以提取的总RNA为模板，按照逆转录试剂盒（PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）说明书进行，合成第一链cDNA。

根据GenBank数据库及转录组测序数据，设计扩增黄颡鱼硒蛋白基因序列的引物（表1）。包括目的cDNA核心片段及3′和5′末端，采用巢式PCR反应扩增目的片段，其中Outer-PCR反应参数为：95 ℃预变性5 min；然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ l min，共25个循环；最后72 ℃延伸5 min。Inner-PCR反应参数为：95 ℃预变性5 min；然后95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min［

18］。扩增所得目的片段，采用Omega公司胶回收试剂盒进行回收提纯，然后将目的片段克隆到pMD™19-T （TaKaRa）载体，转化到DH5α感受态细胞中，后续将转化的菌液均匀涂在含氨苄的LB平板上，随机挑选菌落进行PCR检测，将带有目的条带的菌液送至武汉擎科生物有限公司测序。

表1  黄颡鱼硒蛋白基因cDNA克隆引物序列
Table 1  Nucleotide sequences of the primers used for the cDNA cloning
引物Primers序列Sequences (5'-3')
3'-RACE PCR
3' selenow2a-outer GAGGTATCTGGCTTCGTTGG
3' selenow2a-inner GCCACCTTGCGTCATACTCT
3' selenop2-outer AGGACCAAGAACACTACCATT
3' selenop2-inner ACATGCTTCAGTTATCGCTCT
3' selenot2-outer GAATACTCCAGGTCTATCAGCC
3' selenot2-inner CTGCTTGCCATTGCTCTGA
3' RACE outer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
3' RACE inner CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG
5'-RACE PCR
5' selenow2a-outer TGCCAACGAAGCCAGATAC
5' selenow2a-inner TAGCCTCATCCGCCACAAT
5' selenop2-outer GATTCCCTCTGCTGTTCGTT
5' selenop2-inner CCACGAATAGCGTTGAAGC
5' selenot2-outer GATTCATCTTGAGGTGGTTGTC
5' selenot2-inner TCAGAGCAATGGCAAGCAG
5' RACE outer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5' RACE inner CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG

1.3 序列分析

使用DNAStar 软件拼接序列片段，获得cDNA全长。拼接好的cDNA 序列通过NCBI进行Blast分析，以确定该序列命名是否正确。使用DNAStar软件，找出目的基因的开放阅读框（open reading frame，ORF），将其翻译成氨基酸序列，并使用Clustal-W软件进行氨基酸多序列比对和氨基酸相似性分析。在GUIDANCE网站 （http：//guidance.tau.ac.il/）上对氨基酸多序列进行比对、剪切操作［

19］，并采用MEGA 6.0软件的邻接法（NJ）构建构建进化树，每个节点的可信值设置为1 000 次重复计算。使用SECISearch3 （http：//gladyshevlab.org/selenoproteinpredictionserver）预测得到硒蛋白的SECIS元件，使用SECISln （http：//genome.crg.es/software/SECISaln/）获得SECIS元件的标准模型［18］。

1.4 硒蛋白基因的组织表达分析

采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测黄颡鱼硒蛋白基因的组织表达情况［

18］。各组织样品的总RNA提取方法同本文“1.2”，按照逆转录试剂盒（TaKaRa）说明书进行操作。荧光定量PCR引物如表2所示。本试验用GeNorm进行标准化选出在黄颡鱼不同组织中稳定表达的hprt和b2m作为内参基因，以2-ΔΔCt法计算硒蛋白基因的组织表达水平。

表2  硒蛋白基因荧光定量PCR引物
Table 2  Primers for quantitative PCR of selenoprotein genes
基因 Genes正向引物 Forward primer (5'-3')反向引物 Reverse primer (5'-3')登录号 Accession No.
selenow2a TACGAACCCCGCTATCAGGA ATCGTGGGCTTTCTGGATGG ON109398
selenop2 CAGGACGCTTTTTCAAGGGC GGCAGCACAATGTGAAACGT ON313812
selenot2 CACACACAGGCAGAACAAGC AGCTGGCTGATAGACCTGGA ON109397
18S rRNA AGCTCGTAGTTGGATCTCGG CGGGTATTCAGGCGAGTTTG KP938527
β-actin GGACTCTGGTGATGGTGTGA CTGTAGCCTCTCTCGGTCAG EU161066
gapdh GCCTCCTGCACCACAAACT GCCTTGTTGAGCTTGACGAA KP938522
tuba TCAAAGCTGGAGTTCTCGGT AATGGCCTCGTTATCCACCA KP938526
b2m GCTGATCTGCCATGTGAGTG TGTCTGACACTGCAGCTGTA KP938520
elfa GTCTGGAGATGCTGCCATTG AGCCTTCTTCTCAACGCTCT KU886307
ubce TCAAGAAGAGCCAGTGGAGG TAGGGGTAGTCGATGGGGAA KP938524
hprt ATGCTTCTGACCTGGAACGT TTGCGGTTCAGTGCTTTGAT KP938523

1.5 数据处理

试验数据用SPSS 26.0软件（SPSS，Michigan Avenue，Chicago，IL，USA）进行处理，结果以“平均值±标准误” （mean±SEM，n＝3） 表示，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s多重比较检验进行不同组间指标差异性的统计检验。统计分析之前用Kolmogorov-Smirnov检验所有数据的正态分布性，以Levene检验分析方差齐性，显著性水平为α= 0.05［

17-18］。

2 结果与分析

2.1 selenow2a、selenop2和selenot2基因的分子特征和进化关系

本研究使用RT-PCR和RACE的方法获得了selenow2a、selenop2和selenot2的cDNA全长序列，长度分别为891、1 998和1 432 bp，其中ORF长度分别是288、828和600 bp，能够编码的氨基酸个数分别为95、275和219个（表3）。将黄颡鱼selenow2a、selenop2和selenot2基因预测得到的氨基酸序列与斑马鱼（Danio rerio）进行比较，发现氨基酸相似性分别为82.24%、66.19%和79.45%，而与斑点叉尾鮰（Ictalurus punetaus）的氨基酸相似性分别为94.74%、68.50%和90.95%。

表3  硒蛋白基因cDNA序列信息
Table 3  cDNA sequence information of the selenoprotein genes
基因 Genes登录号 Accession No.5' UTR/bpORF/bp3' UTR /bp全长/bp Full length蛋白/aa Protein
selenow2a ON109398 128 288 475 891 95
selenop2 ON313812 80 828 1090 1998 275
selenot2 ON109397 108 660 664 1432 219

  

cDNA序列中存在编码Sec的终止密码子，在3′非编码区有SECIS元件序列（图1）。黄颡鱼selenow2a、selenop2和selenot2基因预测的氨基酸结构域中存在保守的氧化还原序列CXXU（U为Sec，X为任意氨基酸）。其中Selenow2a结构域中还包括有硒蛋白Rdx结构域和硫氧还蛋白样超家族，Selenop2结构域包括信号肽区域和富组氨酸区域，Selenot2结构域包括硒蛋白Rdx结构域（图2）。AAUGA保守序列存在于黄颡鱼Selenow2a、Selenop2和Selenot2的SECIS元件上（图3）。

图1  黄颡鱼selenow2a基因（A）、selenop2基因（B）和selenot2基因（C）的核苷酸序列及其氨基酸序列和功能域

Fig.1  Nucleotide sequence of the selenow2a（A），selenop2（B） and selenot2（C） gene of yellow catfish and its deduced amino acid sequence and predicted functional domain

编码硒代半胱氨酸的终止密码子以粗体显示，并将U用方框标记，在3'非编码区中预测的硒代半胱氨酸插入序列（SECIS）用下划线显示。The termination codon translated into selenocysteine is shown in bold and the U is marked with a box. The predicted selenocysteine insertion sequence （SECIS） in the 3′ untranslated region is shown as a underline.

图2  Selenow2a（A）、Selenop2（B）和Selenot2（C）氨基酸序列多重比对

Fig.2  Multiple amino acid sequence alignment of Selenow2a（A），Selenop2（B） and Selenot2（C）

Pf：黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco； Ip：斑点叉尾鮰 Ictalurus punctatus； Dr：斑马鱼 Danio rerio； Hs：智人 Homo sapiens； Rn：褐家鼠 Rattus norvegicus.

；

使用序列上方的横线标记Rdx结构域和硫氧还蛋白样超家族；横线代表氧化还原序列CXXU（U为Sec，X为任意氨基酸）；Sec（U）使用（★）代表；保守的U位置用椭圆标记。方框代表信号肽区域和富组氨酸区域。Horizontal line above the sequences denotes the Rdx structural domain and thioredoxin-like superfamily. The horizontal line below the sequence shows the redox sequence CXXU （U is Sec，X is any amino acid）. Sec（U） is represented using （★）. The conservative U position is marked with an ellipse. The boxes indicate signal peptide regions and histidine-rich regions.

图3  黄颡鱼硒蛋白SECIS元件分析与比较

Fig.3  Analysis and comparison of selenoprotein selenocysteine insertion sequence （SECIS）elements of selenoprotein genes from yellow catfish

A：结构图；B：SECIS元件序列。A：Structural diagrams；B：SECIS element sequences.

在进化关系上，黄颡鱼Selenow2a与斑点叉尾鮰的Selenow2a进化关系更加密切，而与斑马鱼Selenow2a、黄颡鱼同源蛋白Selenow、人类Selenow和大鼠Selenow关系较远（图4A）。Selenop2则与斑马鱼Selenop的同源蛋白Selenopb（Selenop2）在进化上更为亲近，而与其他物种关系较为疏远（图4B），黄颡鱼Selenot2的进化关系与Selenop2较为类似（图4C）。

图4  Selenow2a（A）、Selenop2（B）和Selenot2（C）氨基酸序列系统进化树

Fig.4  Phylogenetic tree based on Selenow2a （A），Selenop2 （B） and Selenot2 （C） sequences

硒蛋白来源于黄颡鱼和其他脊椎动物并标注其登录号。These selenoproteins were derived from yellow catfish and vertebrate，and their accession numbers were shown.

2.2 selenow2a、selenop2和selenot2基因的组织表达分析

通过实时荧光定量PCR检测克隆的黄颡鱼selenow2a、selenop2和selenot2基因在8种组织中的mRNA表达水平，结果如图5所示。黄颡鱼selenow2a mRNA在各个组织中广泛表达，表达水平最高的是卵巢，而心脏中mRNA表达相对较低（图5A）。selenop2在各个组织中广泛分布，其mRNA表达最高和最低分别是卵巢和脾脏 （图5B）。selenot2的心脏、肠、肝脏中mRNA表达水平较高，最高的是肠，而脑、精巢、卵巢、脾脏中很低（图5C）。总的来说，表达水平具有组织特异性。

图5  硒蛋白基因selenow2a （A），selenop2 （B） 和selenot2 （C）在黄颡鱼不同组织中的分布和表达

Fig.5  The distribution and expression of selenoprotein genes selenow2a （A），selenop2 （B） and selenot2 （C） in different tissues in yellow catfish

H：心脏 Heart； B：脑 Brain； I：肠 Intestine； L：肝 Liver； M：肌肉Muscle； T：精巢 Testis； O：卵巢 Ovaries； S：脾脏 Spleen.柱上不同字母表示基因表达具有显著差异（P<0.05，单因素方差分析）。Various letters indicate different genes expressions（P<0.05，one-way ANOVA）.

3 讨论

本研究克隆并获得3个黄颡鱼硒蛋白基因selenow2a、selenop2和selenot2，并在克隆得到的3个硒蛋白基因的cDNA序列中发现编码Sec的终止密码子和在3′非编码区发现SECIS元件，确定了克隆得到的基因属于硒蛋白家族［

8］。比较和分析预测得到的氨基酸序列和结构域，发现3个克隆的基因与斑马鱼、斑点叉尾鮰都有比较高的氨基酸相似性和相似结构域，暗示它们在进化过程中是保守的［9-10，20-21］。通过比对不同物种之间硒蛋白基因以及亚型基因之间的进化关系，进一步说明了这种保守的现象。最后，检测了3个硒蛋白基因在黄颡鱼8种测试组织中的表达分布，结果表明3个硒蛋白基因具有组织特异性。

克隆得到的selenow2a是黄颡鱼selenow的亚型基因。已有的研究报道了selenow在黄颡鱼多个组织中表达分布，并且发现在黄颡鱼的鳃中表达量最高［

16］。但是本研究结果显示selenow2a在卵巢中表达水平最高。有研究人员发现雌性塞内加尔鳎（Solea senegalensis）的卵母细胞生长中会增加selenow2a的表达，这是一种抗氧化保护措施［22］，因此，我们推测selenow2a基因在黄颡鱼卵巢中的高mRNA表达可能和雌性黄颡鱼后续的卵巢发育有关。本研究在预测的结构域中发现了与氧化还原调节相关的CXXU序列和硫氧还蛋白样折叠结构，暗示Selenow2a能够参与机体的抗氧化反应［9］，这与之前报道的Selenow类似［16］，这可能与2个基因具有相近的ORF长度和氨基酸数目有关。氨基酸同源性比较和系统发育树分析的结果表明黄颡鱼Selenow2a和斑点叉尾鮰Selenow2a在进化关系中最接近。

Selenop是唯一已知的含有多个Sec的硒蛋白，主要将硒从肝脏传递到其他器官［

23］，在人类中有10个，而在斑马鱼中发现了17个［9］，之前的研究报道了在黄颡鱼的selenop基因上发现了13个Sec［16］。然而，在本研究中克隆得到selenop2的cDNA序列中仅发现了1个Sec，以及3'非编码区也仅含有1个SECIS元件，这和斑马鱼中的基因selenop2是类似的结果［9］，这可能表明Selenop2不参与机体中硒的传递。本研究克隆的selenop2的cDNA序列相较于数据库中selenop2基因多出了SECIS元件，证明了克隆得到的selenop2属于硒蛋白家族。结构域分析发现了保守区域UXXC氧化还原序列，这种保守序列暗示Selenop2能够参与黄颡鱼的氧化还原稳态调节。此外，氨基酸同源性和系统发育树的分析结果显示黄颡鱼Selenop2和斑马鱼Selenopb（Selenop2）在进化上最近。有趣的是，黄颡鱼的selenop基因和selenop2基因在不同的组织表达水平是不同的［16］，表现出基因表达的特异性。Selenop2和Selenop生物组织定位、生化特异性和进化关系之间的差异可能有助于理解硒蛋白P的独特。

Selenot2和黄颡鱼Selenot具有同源关系，与Selenot具有类似的硒蛋白Rdx结构域和保守的CXXU氧化还原序列，暗示其具有氧化还原功能。氨基酸同源性和系统发育树的分析结果表明黄颡鱼Selenot2和斑马鱼Selenot2在进化中关系最近。黄颡鱼selenot2基因主要在黄颡鱼的心脏、肠、肝脏和肌肉中表达。相关研究表明，Selenot在保护金鱼（Carassius auratus）的心脏免受缺血再灌注（Ischemia-Reperfusion，IR）损伤时发挥了重要作用［

24］，因此，我们猜测selenot2基因在黄颡鱼心脏中的高mRNA水平可能也有这种作用。

本研究通过RACE克隆获得3个黄颡鱼硒蛋白基因（selenow2a、selenot2和selenop2）并使用生物信息学技术推测出它们的氨基酸序列。通过与斑马鱼、斑点叉尾鮰对比分析，发现3个硒蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列在鱼类中存在保守的序列，并且可以在人类和大鼠中找到，表明这些保守序列可能在不同物种的硒蛋白功能的稳定发挥中扮演重要角色。实时荧光定量PCR结果显示，3个硒蛋白基因在黄颡鱼体内均有表达，但不同的组织中表达水平差异显著，这可能与硒蛋白功能有关，还需要进一步深入的研究。

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