摘要
为明确番茄接种根结线虫后基因种类和表达量在转录水平的变化规律，利用RNA-seq对未接种及接种南方根结线虫2龄幼虫6、12、24和48 h的番茄进行转录组测序，探究番茄响应南方根结线虫侵染相关的关键转录因子，并采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。结果显示，接种南方根结线虫后6、12、24和48 h分别有350、390、580、1 154个基因差异表达，其中差异表达转录因子分别为11、11、19、50个。这些转录因子属于15个家族，其中数量最多的为MYB家族和bHLH家族（均为20个），其次是ERF家族19个、WRKY家族15个、bZIP家族9个。南方根结线虫侵染过程差异表达最明显的主要为ERF、WRKY、MYB和bHLH家族转录因子，其中Solyc03g005520、Solyc02g094270和Solyc09g066350显著上调，接种后48 h log2FC分别为 9.16、6.49和6.33；Solyc02g079280、Solyc12g100140 和Solyc04g072460显著下调，接种后48 h log2FC分别为-2.60、-1.72和-1.70。qRT-PCR验证结果显示，6个随机选取基因的表达趋势与测序结果基本一致。以上结果表明，ERF、WRKY、MYB和bHLH家族转录因子可能参与番茄与南方根结线虫互作，在番茄响应南方根结线虫侵染反应中发挥着重要的调控作用。
植物依靠复杂的信号传导机制应对各种不良环境因素胁迫及细菌、真菌、线虫等生物侵染，通过多组分协同作用建立起对不良环境及生物胁迫的防卫反应。植物的防卫反应涉及分子、细胞、生化和生理水平的变化，这些变化通常受到胁迫响应基因表达的调
抗南方根结线虫野生番茄材料F5采自广西柳州市郊区，经抗性鉴定为高抗材
将番茄材料（F5）播种于育苗盆中，放置于温室大棚内培养。将4片真叶的番茄苗移栽到直径20 cm、高12 cm的花盆中，每盆种植3株，共20盆60棵。移栽后10 d处理组（T1_6 h、T2_12 h 、T3_24 h、T4_48 h）每盆接种含1 500头南方根结线虫2龄幼虫的线虫液，对照组（T0_CK）接种等量清水，处理组和对照组分别设置4个重复。将处理组和对照组置于25 ℃培养箱进行培养，接种6、12、24、48 h后分别取番茄植株根尖组织3 cm（约500 mg），利用RNA-seq技术分析番茄对南方根结线虫侵染早期的防卫机制。每个样本同时取2份，1份送北京诺禾致源科技股份有限公司测序，另1份经液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱中用于后续qRT-PCR验证。
通过Illumina HiSeq 4000平台获得的原始序列（raw reads），经过匹配、过滤低质量的碱基得到高质量的质控数据（clean reads）。将质控后的原始序列与参考基因组进行比对，只保留能够特异比对到番茄基因组的片段用于后续分析。
以Log2（FoldChange）>1和q-value<0.005作为筛选条件，用DEseq软件对接种后6 h和对照组（T1_6 h VS T0_CK ）、接种后12 h和对照组（T2_12 h VS T0_CK）、接种后24 h和对照组（T3_24 h VS T0_CK）及接种后48 h和对照组（T4_48 h VS T0_CK）4组材料进行差异表达基因筛选。以q-value<0.05作为阈值，对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。
随机选取差异表达的6个基因，利用NTI-11软件设计扩增引物（
| 基因 Gene | 引物 Primer（5'-3'） | 产物长度/bp Length of product |
|---|---|---|
| Solyc01g008370.3 | F:TCCGAAGTGTAATTGCTCTCCA R:ACAAGGCAGATTCAGGTTCCA | 196 |
| Solyc01g103540.3 | F:TTATACACTCACGCAGTCCTCT R:TTCTCACCAGCCATTATCAAGC | 182 |
| Solyc02g077430.3 | F:ATTGGTGCATCATGGCTTCTAC R:CCTCGTCGTCCTTGTATTCCT | 131 |
| Solyc03g093140.3 | F:TTGCTGTTGTTGGCGTGGTA R:GCTGATTCCTCTTCTCCGTCTG | 154 |
| Solyc09g007250.3 | F:TCCGTCCAGATGTAGTCACCTA R:GAGTACCACCACCAGGAACAC | 159 |
| Solyc12g042080.2 | F:GGTCGTATCCTTGCTGGTACA R:GTGCCTCTTCTCGTATCTCTGA | 111 |
| actin | F:ACCTTCAACGTTCCAGCTATG R:TCACCAGAGTCCAACACAATAC | 95 |
对照组（T0_CK）与试验组（T1_6 h、T2_12 h 、T3_24 h、T4_48 h）原始数据统计结果显示raw reads数分别为60 684 056、60 049 986、60 428 048、61 968 290、60 039 864个，经过质控后得到的clean reads数分别为59 091 036、58 226 170、56 221 382、56 080 056、57 531 918个。对各样品的reads进行质量检测，各样品的Q30在90.45%~91.66%，Q20在97.94%~98.48%。利用HISAT软件将所得reads与番茄基因组参考序列（https：//solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersi-coides/genome，2018）比对，分别有57 314 420、56 129 943、53 576 560、54 637 193、53 004 753个reads可特异性比对到番茄基因组上（
样品 Sample | 原始序列数Raw reads | 高质量序列Clean reads | Q20/% | Q30/% | 比对到基因组 Total mapped | 多个比对位置 Multiple mapped |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照Control(T0_CK) | 60 684 056 | 59 091 036 | 98.26 | 91.66 | 57 314 420(96.99%) | 1 031 024(1.74%) |
| Experimental(T1_6h) | 60 049 986 | 58 226 170 | 98.24 | 91.23 | 56 129 943(96.40%) | 1 079 231(1.85%) |
| Experimental(T2_12h) | 60 428 048 | 56 221 382 | 97.94 | 90.45 | 53 576 560(95.30%) | 1 316 381(2.34%) |
| Experimental(T3_24h) | 61 968 290 | 56 080 056 | 98.07 | 90.81 | 54 637 193(97.43%) | 1 050 880(1.87%) |
| Experimental(T4_48h) | 60 039 864 | 57 531 918 | 98.48 | 91.42 | 53 004 753(92.13%) | 1 644 287(2.86%) |
将接种南方根结线虫后6、12、24、48 h与0 h样品的转录组数据进行对比分析，筛选差异表达基因。结果显示，接种南方根结线虫后6、12、24、48 h分别有350、390、580、1 154个差异表达基因。其中上调表达基因分别为136、204、328、674个，下调表达基因分别为214、186、252、480个（
图1 样本间差异表达基因的数量及维恩图
Fig.1 Number and Venn diagrams of differentially expressed genes between samples
A：样本间差异表达基因数 Differentially expressed genes between samples B：样本间差异表达基因的维恩图 Venn diagrams of differentially expressed genes.
对差异表达基因进行GO功能注释，结果显示，各样本间差异表达的基因主要包含于生物过程（biological process）和分子功能（molecular function）。 T1_6 h VS T0_CK 差异表达基因共富集到659条GO条目。其中，差异表达基因数最多的是biological process（214个），其次是single-organism process（95个），single-organism metabolic process为 81个；T2_12 h VS T0_CK 差异表达基因共富集到430条GO条目。其中差异表达基因数最多的是biological process （210个），其次是single-organism process（104个），single-organism metabolic process为 79个；T3_24 h VS T0_CK差异表达基因共富集到896条GO条目。其中，差异表达基因数最多的是biological process（306个），其次是single-organism process（142个），single-organism metabolic process 为119个； T4_48 h VS T0_CK差异表达基因共富集到1 338条GO条目。其中，差异表达基因数最多的是biological process（628个），其次是catalytic activity和single-organism process，分别为478和285个（
图2 差异表达基因的GO分析
Fig.2 The GO annotations analysis of differentially expressed genes
T1_6 h VS T0_CK差异表达基因显著富集到9条主要的代谢通路，其中富集因子最高的是氮代谢（nitrogen metabolism），其次是苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）。而富集差异基因最多的途径为次生代谢物生物合成（biosynthesis of secondary metabolites），共富集到35个差异表达基因，其次为苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis），有11个差异表达基因被富集到该途径。T2_12 h VS T0_CK 差异表达基因显著富集到8条主要代谢通路。其中，次生代谢物生物合成富集因子最高，其次为异喹生物碱生物合成（isoquinoline alkaloid biosynthesis）；次生代谢物生物合成途径富集差异基因最多，共富集到47个差异表达基因，其次为植物激素信号传导（plant hormone signal transduction），富集到11个差异表达基因。T3_24 h VS T0_CK差异表达基因显著富集到8条主要代谢通路，富集因子最高的是苯丙烷生物合成，次生代谢物生物合成次之；代谢途径富集差异基因最多，共富集到85个差异表达基因，次生代谢物生物合成次之，共富集到65个差异表达基因；T4_48 h VS T0_CK差异表达基因显著富集到18条主要的代谢通路，其中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解富集因子最高，其次为次生代谢物生物合成；而次生代谢物生物合成途径富集差异基因最多，共富集到132个差异表达基因，其次为植物激素信号传导途径，共富集到33个差异表达基因（
图3 差异表达基因的KEGG分析
Fig.3 The KEGG annotations analysis of differentially expressed genes
对差异表达的转录因子进行分析发现，接种南方根结线虫后6、12、24和48 h分别有11、11、19、50个转录因子差异表达。这些转录因子属于15个家族，其中数量最多的为MYB家族和bHLH家族（均为20个），其次是ERF家族19个、WRKY家族15个、bZIP家族9个（
图4 差异表达的转录因子
Fig.4 Differentially expressed transcription factors between samples
对差异表达明显的转录因子进行分析发现，Solyc03g005520、Solyc02g094270和Solyc09g066350显著上调，接种后48 h log2FC分别为9.16、6.49和6.33；Solyc02g079280、Solyc12g100140 和Solyc04g072460显著下调，接种后48 h log2FC分别为-2.60、-1.72和-1.70。说明这几个转录因子可能参与番茄与南方根结线虫互作，在番茄响应南方根结线虫侵染反应中发挥着重要的调控作用（
图5 根结线虫感染后转录因子DEGs的热图
Fig.5 Heatmap showing the DEGs of transcription factors after infection by RKNs
随机选取Solyc01g008370.3、Solyc01g103540.3、Solyc02g077430.3等6个基因进行qRT-PCR，计算其表达量并换算成log2FC，然后与RNA测序结果进行比较（
图6 差异表达基因的qRT-PCR验证
Fig.6 Verification of genes by qRT-PCR
转录因子在植物应对各种不良环境及生物胁迫中通过调控抗性相关基因的表达，改善植物的抗逆性。番茄基因组中WRKY、DOF、MYB、bZIP、ARF、ERF、HSF和NAC等转录因子通过激活或抑制不同的植物代谢活动，在番茄应对不良环境及生物胁迫中发挥重要作
ERF家族转录因子广泛存在植物中，研究发现ERF转录因子通过结合在靶标基因启动子上的GCC盒（GCCGCC）调控其表
WRKY转录因子是一类进化保守的转录因子家族，它通过与靶标基因特定区域相结合，调控下游抗病基因的表达，参与调控植物的抗病防卫系
MYB是植物界最大的转录因子家族之一，其成员在植物应对生物及非生物胁迫中发挥多种功
bHLH家族转录因子因其bHLH结构域而得名。番茄基因组中共发现了152个bHLH转录因子，番茄黄化卷叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）感染导致4个bHLH转录因子（SlbHLH077、SlbHLH079、SlbHLH131、SlbHLH132）差异表达，其中在抗性株系中沉默SlbHLH131可导致细胞死
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