摘要
为探究不同品种淡水鱼转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）对肌球蛋白凝胶特性的影响，以鲢和青鱼肌球蛋白为试验对象，分别测定鲢转谷氨酰胺酶（silver carp transglutaminase，STG）和青鱼转谷氨酰胺酶（black carp transglutaminase，BTG）作用下肌球蛋白在低温凝胶化后溶解度、蛋白聚集、流变学特性、穿刺特性和微观形貌的变化。结果显示：与未加酶组相比，添加2种TGase后均可催化鲢或青鱼肌球蛋白交联形成更多的ε-（γ-Glu）-Lys异肽键，导致肌球蛋白重链（myosin heveay chain，MHC）的聚集程度增加，蛋白浊度值及平均粒径显著增大（P<0.05），肌球蛋白凝胶的弹性模量（G'）明显增大，凝胶破断力和破断距离显著提升（P<0.05），蛋白网络结构增强。在提升同种肌球蛋白凝胶特性方面，BTG的催化交联作用强于STG；而BTG的比酶活（12.67 U/mg）低于STG的比酶活（14.34 U/mg），且无论是否添加TGase，青鱼肌球蛋白的凝胶特性始终高于鲢肌球蛋白。综上，不同品种淡水鱼糜凝胶特性的差异并非主要由TGase的活性差异所导致，而与其肌球蛋白的来源密切相关。
我国淡水渔业资源丰富，2021年淡水鱼养殖产量高达2 640.28万t，位居世界第
因此，本研究以鲢和青鱼肌球蛋白为对象，分析在鲢转谷氨酰胺酶（STG）和青鱼转谷氨酰胺酶（BTG）作用下肌球蛋白凝胶化后溶解度、蛋白聚集、流变学特性、穿刺特性和微观形貌的变化及差异，以明确不同品种淡水鱼糜的凝胶特性存在差异的原因，旨在为淡水鱼糜凝胶的品质调控提供理论依据。
新鲜鲢（约2 kg/尾）、青鱼（约4 kg/尾）购于华中农业大学校内农贸市场，将其放置在水箱中保活运至实验室后，于低温间宰杀，取鱼背部白肉备用。
牛血清蛋白、N，N-二甲基酪蛋白（DMC）、丹酰尸胺等分析纯试剂购于美国Sigma-Aldrich公司；三羧甲基氨基甲烷（Tris）、碳酸钠、酒石酸钾钠、五水硫酸铜、硫酸铵、氯化钠、氯化钙、盐酸、氯化钾、醋酸镁、碳酸氢钾、氯化镁、十二烷基硫酸钠（SDS）、三氯乙酸（TCA）、尿素、氢氧化钠、叠氮钠、ATP二钠盐（ATP-Na2）等分析纯试剂购于国药集团化学试剂有限公司；甘氨酸、蛋白质上样缓冲液、次高分子标准蛋白（Marker）均为电泳纯，购于Biosharp公司；考马斯亮蓝R-250、β-巯基乙醇，购于美国Amresco公司。
K600（3205）型食品料理机，德国博朗公司；AvantiJ-2型高速冷冻离心机，美国贝克曼公司；T80高速分散均质机，德国IKT公司；UV-1750型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；F-4600型荧光光度计，日本日立公司；AKTA pure L蛋白多糖分离纯化系统，美国思拓凡公司；AR2000ex动态流变仪，美国TA公司；JSM-6390LV场发射扫描电子显微镜，天美（中国）科学仪器有限公司；DYY-6C电泳仪，美国Bio-Rad公司；NanoZs纳米粒度电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；TA-XT Plus物性分析仪，英国Stable Micro System公司。
以1∶10料液比将鱼肉与缓冲液（20 mmol/L Tris、5 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT、0.01% NaN3混合，pH 7.5）混合，斩拌破碎为鱼浆，8 000 r/min均质2 min，低温振荡30 min后离心，取上清液，沉淀以1∶10的料液比复溶，进行二次提取，合并2次提取的上清液即为TGase粗酶液。
TGase粗酶液的纯化参考Zhang
TGase的活性测定参考Hemung
参考魏
肌球蛋白质量浓度调整至20 mg/mL，参考Benjakul
采用动态光散射测定肌球蛋白溶液中微粒的大小与分布，以量化肌球蛋白凝胶化后的聚集程度。将肌球蛋白质量浓度调整至0.2 mg/mL，参考Wei
肌球蛋白质量浓度调整为20 mg/mL，参考贾丹
鱼糜凝胶形成过程中的黏弹性可以通过弹性模量G'和损耗因子tanδ表征。肌球蛋白质量浓度调整至20 mg/mL，参考Xue
肌球蛋白的质量浓度调整为20 mg/mL，参考程梦颖
STG/BTG作用鲢和青鱼肌球蛋白凝胶的溶解度如
图1 STG/BTG作用下肌球蛋白凝胶的溶解度
Fig. 1 Solubility of myosin gel catalyzed by STG or BTG
CK为未添加TGase的空白组；BM、SM分别为青鱼肌球蛋白、鲢肌球蛋白；不同大写字母表示同一处理下BM与SM之间存在显著差异（P<0.05）；不同小写字母表示不同TGase处理下同种肌球蛋白存在显著差异（P<0.05）。下同。CK represents the blank group without TGase； BM， SM represent the myosin from black carp， silver carp， respectively. Different capital letters mean significant differences between BM and SM under the same treatment（P<0.05）.Different lowercase letters mean significant differences in myosins under different TGase treatments（P<0.05）.The same as below.
图2 STG/BTG作用下肌球蛋白的浊度
Fig. 2 Turbidity of myosin catalyzed by STG or BTG
图3 STG/BTG作用下肌球蛋白的粒径分布（A）与平均粒径（B）
Fig. 3 The size distribution （A） and average particle size （B） of myosin catalyzed by STG or BTG
STG/BTG作用下鲢和青鱼肌球蛋白凝胶的SDS-PAGE图谱及主要蛋白含量如
图4 STG/BTG作用下肌球蛋白凝胶的SDS-PAGE图谱（A）及MHC含量（B）、高分子质量蛋白含量（C）
Fig. 4 The SDS-PAGE（A），MHC content（B） and high molecular weight protein content（C）of myosin gel catalyzed by STG or BTG
由
图5 STG/BTG作用下热诱导肌球蛋白凝胶的G' （A）和tanδ （B）
Fig. 5 G' （A） and tanδ （B） of heat-induced myosin gel catalyzed by STG or BTG
STG/BTG作用下鲢和青鱼肌球蛋白凝胶的破断力（A）与破断距离（B）如
图6 STG/BTG作用下肌球蛋白凝胶的破断力（A）与破断距离（B）
Fig. 6 Breaking force （A） and breaking distance （B） of myosin gel catalyzed by STG or BTG
未加酶时，青鱼肌球蛋白凝胶的破断力和破断距离大于鲢肌球蛋白凝胶，说明青鱼肌球蛋白的凝胶形成能力较好。添加2种TGase后，鲢和青鱼肌球蛋白凝胶的破断力与破断距离均显著提升（P<0.05），说明添加任一种来源的TGase，均可提高鲢或青鱼肌球蛋白的凝胶强度。对同一肌球蛋白，BTG处理后凝胶的破断力与破断距离显著大于STG处理组（P<0.05），而在相同TGase作用下，青鱼肌球蛋白凝胶的破断力与破断距离显著大于鲢肌球蛋白处理组（P<0.05）。
结果表明，以BTG为催化酶或青鱼肌球蛋白为底物时，肌球蛋白凝胶强度更大，这与ε-（γ-Glu）-Lys键的含量变化趋势一致。
BTG/STG处理下鲢和青鱼肌球蛋白凝胶的微观形貌如
图7 STG/BTG 作用下肌球蛋白凝胶的扫描电镜图片（10 000×）
Fig. 7 SEM images of myosin gel catalyzed by STG or BTG（10 000×）
在鱼糜低温凝胶化阶段，肌球蛋白分子受热后先通过头-头进行聚集，尾部向外伸展，随加热时间的延长，尾部暴露出更多的交联位
在相同TGase作用下，与鲢肌球蛋白相比，青鱼肌球蛋白形成了更多的ε-（γ-Glu）-Lys键，其聚集程度更高，凝胶的G'、破断力与破断距离显著高于鲢肌球蛋白凝胶，三维网络结构更为致密有序，表现出良好的凝胶特性。这种差异可能与肌球蛋白中赖氨酸、谷氨酸的含量有关，青鱼糜中谷氨酸、赖氨酸的含量高于鲢鱼糜，故TGase对青鱼肌球蛋白有更强的选择
综上所述，STG/BTG对鲢或青鱼肌球蛋白的溶解度、蛋白聚集、流变学特性、穿刺特性及微观形貌有显著影响，且相同处理下的不同肌球蛋白的凝胶特性存在差异。当BTG为催化酶或者青鱼肌球蛋白为底物时，肌球蛋白的凝胶特性更好。由于BTG的酶活小于STG，与2种TGase诱导肌球蛋白交联的催化能力不符，可见不同品种淡水鱼糜凝胶特性的差异并非主要由TGase的活性差异所导致，而与肌球蛋白的来源密切相关。
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