草鱼神经肽Y受体对神经肽Y的响应机制及信号通路探究

蓝洁，梁旭方，张焱鹏，翟丽娟，万功伟; LAN Jie; LIANG Xufang; ZHANG Yanpeng; ZHAI Lijuan; WAN Gongwei

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草鱼神经肽Y受体对神经肽Y的响应机制及信号通路探究 PDF

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翟丽娟 ²
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万功伟 ²

1. 华中农业大学水产学院/华中农业大学鳜鱼研究中心/长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，武汉430070； 2. 荆州百湖生态渔业发展有限公司，荆州434000

中图分类号： S917.4

最近更新：2023-08-29

DOI：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2023.04.026

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摘要

为探究草鱼（Ctenopharyngodon idellus）神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）与神经肽Y受体（NPY receptor，YR）的相互作用及信号传递机制，对草鱼YR的基因结构、组织表达和细胞信号传导途径进行分析。结果显示，在草鱼基因组中获取了7个YR基因的序列，分别为Y1R、Y2R、Y2-2R、Y4R、Y7R、Y8Ra和Y8Rb。对草鱼YR进行同源性分析，发现7个YR编码的氨基酸序列在硬骨鱼类中高度保守。组织表达结果显示，草鱼YR主要在中枢组织表达，但也可以位于外周组织，包括眼睛、鳃和肠道。NPY可以激活人胚胎肾细胞（HEK293t）中Y2R、Y4R和Y8Rb的表达，Y2R与cAMP/PKA信号通路偶联；Y4R与MAPK/ERK信号通路偶联；而Y8Rb可激活cAMP/PKA和MAPK/ERK 2条信号通路。脑室注射NPY可引起Y1R、Y2R、Y4R和Y8Rb表达量显著升高。研究结果表明，草鱼Y2R、Y4R和Y8Rb具有功能性，能够有效传递信号，NPY的作用很可能由这些受体介导。

关键词

草鱼; 神经肽Y受体; 神经肽Y; 信号通路

神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）是一种广泛分布于许多物种中的肽，与多种生理功能相关，例如食物摄入、能量代谢、记忆和血压^［

1］。NPY由36个氨基酸组成，主要在中枢和外周神经元的神经分泌细胞中表达^{［参考文献 2

百度学术}2］，通过激活其受体——神经肽Y受体（NPY receptor，YR）实现多种功能。因此，研究YR信号通路对理解这一系统的生理机制至关重要。

YR作为细胞膜NPY的靶点，属于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor）家族成员^［

3］。根据同源性和功能特征，YR又分为Y1、Y2和Y5三个亚家族，其中Y1亚家族包含Y1R、Y4R、Y6R和Y8R，Y2亚家族则包括Y2R和Y7R，Y5亚家族仅有Y5R。在哺乳动物中已经鉴定出Y1R、Y2R、Y4R、Y5R和Y6R^{［参考文献 4-5}4-5］，而Y7R可能已经丢失^{［参考文献 6

百度学术}6］。在硬骨鱼中，已发现Y1R、Y2R、Y4R、Y7R、Y8R以及Y8R的亚型（Y8Ra和Y8Rb）^{［参考文献 6-7}6-7］。此外，在斑马鱼（Danio rerio）和青鳉（Oryzias latipes）中还发现了Y2R的复制产物Y2-2R^{［参考文献 8

百度学术}8］。迄今为止，对哺乳动物YR的功能已有许多的探索。例如，在这些受体中，Y1和Y5被认为参与哺乳动物食欲的调节^{［参考文献 9

百度学术}9］。Y2亚家族的受体主要参与哺乳动物的食欲调节和情感行为^{［参考文献 10

百度学术}10］。根据目前对哺乳动物的研究，YR介导的信号传导主要通过cAMP/PKA和MAPK/ERK 2种途径进行^{［参考文献 11-12}11-12］。然而，这些受体在硬骨鱼类中的生理功能和系统的YR信号通路尚不清楚。

目前，对硬骨鱼类NPY及其受体功能的研究已有较多^［

13-15］，但大多数研究都集中在结合哺乳动物细胞系的分析来克隆和鉴定NPY及YR^{［参考文献 15

百度学术}15］。笔者所在课题组先前的研究发现，NPY是草鱼（Ctenopharyngodon idellus）体内的一种促食欲因子，其中Y8Rb可能参与了草鱼的摄食调节^{［参考文献 13

百度学术}13］。然而，草鱼YR与NPY之间的作用途径仍不清楚。因此，本研究探索草鱼YR对NPY的响应情况及其信号通路，以期探明NPY与YR之间的关系，尤其是在硬骨鱼类中的关系和作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用草鱼购自武汉四汇水产科技有限公司，饲养于华中农业大学水产基地的循环水养殖系统中进行环境适应，水温为（23±2） ℃。每天11：00按体质量的2%饲喂商业漂浮饲料（通威，广州）。HEK293t细胞购自中国典型培养物保藏中心，于37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养。草鱼NPY购自上海吉玛制药技术有限公司，纯度为95%，于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 草鱼YR生物信息学分析

从草鱼基因组数据库（http：//www.ncgr.ac.cn/grasscarp/）中获得草鱼YR序列，分析及确定其序列组成并预测氨基酸序列。利用Clustal（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）进行氨基酸序列多重比对。从GenBank或Ensembl数据库中获取以下22个物种的YR氨基酸序列：短吻鳄（Alligator mississippiensis）、热带爪蟾（Xenopus tropicalis）、鹦鹉（Amazona aestiva）、猪（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、银鲛（Callorhinchus milii）、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）、狗（Canis lupus familiaris）、大鼠（Rattus norvegicus）、豚鼠（Cavia porcellus）、斑马鱼（Danio rerio）、狼鲈（Dicentrarchus labrax）、马（Equus caballus）、鸡（Gallus gallus）、人（Homo sapiens）、斑点雀鳝（Lepisosteus oculatus）、猴（Macaca mulatta）、小鼠（Mus musculus）、兔（Oryctolagus cuniculus）、青鳉（Oryzias latipes）、猩猩（Pan troglodytes）、非洲爪蟾（Xenopus laevis），与草鱼YR氨基酸序列进行多重比对，并利用MEGAX软件以邻接法（neighbor-joining，NJ）构建进化树（bootstrap=1 000）。

1.3 草鱼YR组织表达检测

选取3尾于同一环境养殖的草鱼，利用麻醉剂MS222（20 mg/L）麻醉后分离组织（脑、眼睛、心脏、肌肉、肠、鳃、肝、脾、肾）并于液氮中冷冻保存、备用。用RNAiso Plus（TAKARA，日本）从冷冻样品中提取总RNA，使用1 µg总RNA进行cDNA的反转录合成（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京）。用qRT-PCR检测草鱼7个YR基因的表达水平。反应体系（20 µL）包括：双蒸水8.2 µL，上下游引物各0.4 µL，模板cDNA 1 µL，SYBR（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京）10 µL。反应参数为：95 ℃预变性5 min；然后进行40个循环：95 ℃变性15 s，退火15 s，72 ℃延伸45 s。每个样品设置3个重复。以ef1α为内参基因，引物名称、序列及引物退火温度见表1。

表1 qRT-PCR引物序列及退火温度

Table 1 Primer sequences and annealing temperatures used for qRT-PCR

引物名称 Primer name	引物序列 (5′-3′) Sequence (5′-3′)	退火温度/℃ Annealingtemperature
RT-ef1α-F	GCTGACTGTGCCGTGCTGAT	58
RT-ef1α-R	GCTGACTTCCTTGGTGATTTCC
RT-Y1R-F	CCACCAATTCCACCAGTCAC	57
RT-Y1R-R	ATCGCCATTACAACAAACAAAG
RT-Y2R-F	TCACCTGGGTAGTAAGCG	52
RT-Y2R-R	CAGCAGCGTGGAGATTG
RT-Y2-2R-F	GTTGCTGGACGAATGGAAA	56
RT-Y2-2R-R	GCCGAGGTGGAAGACGA
RT-Y4R-F	CCCTCAATCAAAGCAACAGT	55
RT-Y4R-R	ACCAAGCAAGCCCAAAA
RT-Y7R-F	CGTGTCCATTCTCACCCTG	57
RT-Y7R-R	GGATTTCCTCATAGCGATACTCT
RT-Y8Ra-F	TCTTGGGTGAGACGCTGTGC	60
RT-Y8Ra-R	GTGGTCGCTGAATGGGTTG
RT-Y8Rb-F	CCCACTGGTTGGAAGCC	56
RT-Y8Rb-R	TGAAGGGAAGACTGAGGTTGT

1.4 草鱼YR下游cAMP和P-ERK激活程度检测

1）草鱼YR表达载体构建。从草鱼基因组数据库中调取所需YR基因的CDS序列，根据CDS序列利用Primer 6设计全长扩增引物，以草鱼脑组织cDNA为模板，使用高保真酶（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京）进行PCR扩增，引物信息见表2。扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化，纯化产物使用克隆载体构建重组质粒后进行阳性克隆鉴定，再用康为世纪公司的试剂盒提取质粒，所得质粒DNA用于制备线性化载体，最后根据YR的CDS序列，设计插入片段的重组引物，引物信息见表3。本研究所用扩增引物和重组引物都由生工（中国，上海）公司合成。使用重组引物进行PCR扩增，扩增产物纯化回收后进行重组反应，使用重组反应产物进行转化。转化后的重组产物根据以下体系和参数进行反应，反应体系：双蒸水8 µL，Mix 10 µL，上下游引物各0.8 µL，菌液0.4 µL。反应参数：94 ℃预变性10 s；94 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃后延伸10 min。反应结束后取产物进行阳性克隆鉴定，同时送生工公司测序，测序鉴定成功后将菌液扩大培养，用于DNA提取。

表2 草鱼YR基因CDS全长扩增引物

Table 2 YR genes CDS full-length amplification primers of grass carp

引物名称 Prime name	引物序列 (5′-3′) Sequence (5′-3′)
Y1R-F	ATGCCAGACTCCGCCCTGTC
Y1R-R	CTAGAGATCTAGGCTACTAA
Y2R-F	ATGAACATATCTGAAGATGAA
Y2R-R	TCAGTGAGTATTGATTGGTCT
Y2-2R-F	ATGGATTCCCTCAGCTTAATCA
Y2-2R-R	TCAGACATCTGTTGCGTTGAG
Y4R-F	ATGCTTTGCTGTCTGGAGCTA
Y4R-R	TTACACAGAATTGTTTCTGAGT
Y7R-F	ATGGGCCAATCAGATCTAGCCA
Y7R-R	TCAGACAGCAGCCGCAGGCTGAC
Y8Ra-F	ATGAACTTACCGAACTTCCAGAAATACAC
Y8Ra-R	TTAGCAGTGAGCGCACTGTTCCGAT
Y8Rb-F	ATGGAGCGGTCTCATCTGAACAA
Y8Rb-R	TTAAATGGTCTCTTTCTGTTC

表3 草鱼YR基因重组引物

Table 3 Recombinant primers of YR gene of grass carp

引物名称 Prime name	引物序列 (5′-3′) Sequence (5′-3′)
Y1R-EcoRⅠ	CGGAATTCATGCCAGACTCCGCCCTGTC
Y1R-XbaⅠ	GGCTCTAAGACTAGAGATCTAGGCTACTAA
Y2R-EcoRⅠ	CGGAATTCATGAACATATCTGAAGATGAA
Y2R-XbaⅠ	GGCTCTAAGATCAGTGAGTATTGATTGGTCT
Y2-2R- EcoRⅠ	CGGAATTCATGGATTCCCTCAGCTTAATCA
Y2-2R-XbaⅠ	GGCTCTAAGATCAGACATCTGTTGCGTTGAG
Y4R-EcoRⅠ	CGGAATTCATGCTTTGCTGTCTGGAGCTA
Y4R-XbaⅠ	GGCTCTAAGATTACACAGAATTGTTTCTGAGT
Y7R-EcoRⅠ	CGGAATTCATGGGCCAATCAGATCTAGCCA
Y7R-XbaⅠ	GGCTCTAAGATCAGACAGCAGCCGCAGGCTGAC
Y8Ra-EcoRⅠ	CGGAATTCATGAACTTACCGAACTTCCAGAAATACAC
Y8Ra-XbaⅠ	GGCTCTAGATTAGCAGTGAGCGCACTGTTCCGAT
Y8Rb-EcoRⅠ	CGGAATTCATGGAGCGGTCTCATCTGAACAA
Y8Rb-XbaⅠ	GGCTCTAGATTAAATGGTCTCTTTCTGTTC

2）cAMP和P-ERK激活程度检测。为了检测草鱼YR是否能被NPY激活并具有信号转导能力，使用NPY刺激处理转染了草鱼YR表达载体的HEK293t细胞，检测下游cAMP和P-ERK的激活情况。本试验设置对照组和7个试验组。对照组为转染了空载的HEK293t细胞；试验组为分别转染了Y1R、Y2R、Y2-2R、Y4R、Y7R、Y8Ra和Y8Rb的HEK293t细胞；每组设置6个平行。分别用OG（含BSA）和NPY（10^-6M）刺激转染了不同YR的HEK293t细胞，先进行饥饿处理，后使用cAMP-Glo^TM Assay试剂盒（Promega）按照说明书检测不同YR下游cAMP的激活情况，同时采用目的抗体Phospho-p44/42 MAPK（CST公司）和内参抗体β-tubulin（CST公司），进行Western blot以检测全细胞裂解物中的磷酸化ERK1/2。

1.5 脑室注射NPY后草鱼脑组织YR表达检测

将体质量为（42±5） g的草鱼120尾随机分为2组：对照组注射5 µL PBS；试验组注射0.5 µg/g的NPY溶液（5 µg/µL）。每组设置3个重复，共6个养殖缸，每缸20尾草鱼。注射2 h后于缸中随机取5尾草鱼，利用麻醉剂MS222（20 mg/L）麻醉后分离脑组织并于液氮中冷冻保存、待用。利用qRT-PCR检测试验组和对照组草鱼脑组织中YR基因的相对表达量。

1.6 数据统计与分析

试验数据采用SPSS Statistics 19.0软件进行分析，所有数据均以“平均值±标准误”（Mean±SE）的形式表示。使用单样本t检验（one sample t-test）、独立样本t检验（independent sample t-test）和单因素方差分析（one-way ANOVA）3种方法，分别进行数据分布正态性检测、2个样本的比较分析和多个样本的差异分析。如果P<0.05，则判定数据具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 草鱼YR序列分析

草鱼YR基因序列分析结果显示，草鱼中共发现Y1R、Y2R、Y2-2R、Y4R、Y7R、Y8Ra和Y8Rb 7个YR亚型。其中Y4R、Y7R和Y8Rb只有1个外显子；Y1R具有2个外显子，1个内含子；Y2R和Y2-2R具有3个外显子，2个内含子；Y8Ra具有4个外显子，3个内含子（图1）。

图1 草鱼和斑马鱼YR基因结构

Fig. 1 Genomic organization of the YR genesfrom zebrafish and grass carp

黑色方块表示外显子，黑线表示内含子。The black squares represent exons and the black lines represent introns.

草鱼Y1R与其他物种多重比对结果显示，草鱼Y1R和斑马鱼Y1R相似性最高，为98%；与斑点雀鳝Y1R相似性较高，为84%（图2A）。草鱼Y2R与斑点雀鳝Y2R的相似性最高，为88%；与斑马鱼、青鳉、红鳍东方鲀和狼鲈Y2R的相似性较高，分别为85%、85%、83%和82%（图2B）。草鱼Y2-2R与斑马鱼Y2-2R的相似性最高，为98%；与青鳉Y2-2R的相似性较高，为82%；与红鳍东方鲀Y2-2R的相似性较低，为49%（图2C）。草鱼Y4R与斑马鱼Y4R的相似性最高，为97%，与斑点雀鳝、青鳉、狼鲈和红鳍东方鲀Y4R的相似性较高，分别为79%、73%、73%和70%（图2D）。草鱼Y7R与斑马鱼Y7R的相似性最高，为96%；与红鳍东方鲀、青鳉、斑点雀鳝和狼鲈的相似性较高，分别为85%、84%、84%和84%（图2E）。草鱼Y8Ra与斑马鱼Y8Ra的相似性最高，为95%；与斑点雀鳝、狼鲈、红鳍东方鲀和青鳉的相似性较高，分别为87%、83%、81%和81%（图2F）。草鱼Y8Rb与斑马鱼Y8Rb的相似性最高，为98%；与红鳍东方鲀、狼鲈和斑点雀鳝Y8Rb的相似性较高，分别为83%、83%和79%（图2G）。

图2 草鱼和其他硬骨鱼类Y1R（A）、Y2R（B）、Y2-2R（C）和Y4R（D）氨基酸序列多重比对结果

Fig. 2 Multiple amino acid alignment results of Y1R（A），Y2R（B），Y2-2R（C） and Y4R（D） between grass carp and other fishes

绿色表示疏水性氨基酸，红色表示带电氨基酸，蓝色表示极性氨基酸。Green represents hydrophobic amino acids， red represents charged amino acids， and blue represents polar amino acids.

使用草鱼YR氨基酸序列构建系统发育树，与其他22个物种的YR序列进行进化分析，包括鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物，结果如图3所示。草鱼Y1R、Y4R、Y8Ra和Y8Rb与Y1亚家族聚集在一起，而草鱼Y2R、Y2-2R和Y7R与Y2亚家族聚集在一起。草鱼YR所有亚型都与对应的斑马鱼YR亚型分为一支，具有很高的亲缘性，与两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物的关系较远。

图3 YR系统进化树

Fig.3 Phylogenetic tree analyses of YR

图2 草鱼和其他硬骨鱼类Y7R（E），Y8Ra（F）和Y8Rb（G）氨基酸序列多重比对结果（续）

Fig.2 Multiple amino acid alignment results of Y7R（E），Y8Ra（F） and Y8Rb（G） between grass carp and other fishes （continued）

2.2 草鱼YR mRNA在不同组织中的表达情况

以ef1α为内参基因，草鱼YR mRNA在9个组织（器官）中的相对表达情况如图4所示。Y1R在脑中的表达量最高，其次是眼睛、鳃、肠、心、肌肉和脾，在肾和肝中的表达量最低（图4A）。Y2R在鳃中的表达量最高，其次是肠、脑、眼睛、心、肾和肌肉，在脾和肝中的表达量最低（图4B）。Y2-2R在眼睛中的表达量最高，在脑中的表达量次高，且在眼睛和脑中的表达量显著高于其他组织（P<0.05），在肠中也有少量表达，在鳃、脾、肾、肝、肌肉和心中几乎不表达（图4C）。Y4R在脑中的表达量最高且显著高于其他组织（P<0.05），其次为眼睛和心，在肠、鳃、脾和肾中也有少量表达，在肝和肌肉中几乎不表达（图4D）。Y7R在鳃中的表达量最高，且在鳃、脑和眼睛中的表达显著高于其他组织（P<0.05），其次是脑、眼睛、心、肠、肌肉、脾、肾和肝（图4E）。Y8Ra在脑中的表达量最高且显著高于其他组织（P<0.05），其次为肠、眼睛和鳃，在脾、肾、肝、肌肉和心中几乎不表达（图4F）。Y8Rb在脑中的表达量最高且显著高于其他组织（P<0.05），其次为鳃和眼睛，在心、脾、肌肉和肠中也有少量表达，在肾和肝中几乎不表达（图4G）。

图4 Y1R（A）、Y2R（B）、Y2-2R（C）、Y4R（D）、Y7R（E）、Y8Ra（F）和Y8Rb（G）在草鱼组织中的表达

Fig. 4 The expression profile of Y1R（A），Y2R（B），Y2-2R（C），Y4R（D），Y7R（E），Y8Ra（F） and Y8Rb（G）genes in grass carp tissues

B：脑 Brain；E：眼睛 Eye；Gu：肠道 Gut；Gi：腮 Gill；S：脾 Spleen；K：肾 Kidney；L：肝 Liver；M：肌肉 Muscle；H：心 Heart.用不同字母标记的值之间存在显著差异（P<0.05）。Data with different letters above the bars indicated significant difference （P<0.05）.

2.3 NPY刺激后草鱼YR下游cAMP、P-ERK水平

图5所示为NPY刺激后草鱼YR下游cAMP水平。结果显示，NPY结合Y2R和Y8Rb后，下游信号通路cAMP水平显著高于对照组；而NPY结合Y1R、Y2-2R、Y4R、Y7R和Y8Ra后，下游信号通路cAMP水平无显著变化。如图6所示，NPY结合Y1R、Y2R和Y7R后，下游信号通路P-ERK水平较弱；而NPY结合Y4R和Y8Rb后，下游信号通路P-ERK水平显著高于其他受体（P<0.05）。

图5 草鱼NPY结合不同亚型YR后下游cAMP水平

Fig. 5 cAMP levels of different subtypes of YR in grass carp after combined with NPY

*表示与对照相比差异显著（P<0.05）。The asterisks indicated significant difference （P<0.05）.

图6 草鱼YR下游ERK磷酸化水平

Fig. 6 Phosphorylated ERK level of YR in grass carp

不同字母标记的值之间存在显著差异（P<0.05）。Data with different letters above the bars indicated significant difference （P<0.05）.

2.4 脑室注射NPY后草鱼脑组织YR表达量

为了更好地了解NPY与YR之间的相互作用，本研究检测了脑室注射NPY 2 h后YR在草鱼脑组织中的相对表达量（图7）。结果显示，NPY经脑室注射后对Y7R和Y8Ra的表达均无显著影响（P>0.05）。Y1R、Y2R、Y2-2R、Y4R和Y8Rb的表达量在NPY注射后均显著高于PBS注射组（P<0.05）。

图7 NPY脑室注射后YR在草鱼脑组织中的表达量

Fig. 7 The expression of YR genes in brain of grass carp by ICV administration

*表示与对照相比差异显著（P<0.05）。The asterisks indicated significant difference （P<0.05）.

3 讨论

YR亚型在不同物种中有所不同^［

16-18］。本研究通过对草鱼的基因结构和氨基酸序列分析，发现草鱼共有7个YR亚型，其中包括Y2-2R及硬骨鱼类特有的Y8Ra和Y8Rb。根据系统发育分析结果，在Y2亚家族中，所有物种都具有Y2R，但只有小鼠和部分硬骨鱼类具有Y2-2R，而Y7R只在硬骨鱼类中存在。Y5R和Y6R在草鱼中缺失，这一点与其他硬骨鱼类一致。这一发现表明，Y2亚家族可能具有更保守的功能，而Y1亚家族可能随生活行为而调整功能。

据报道，硬骨鱼类的YR在大脑中表达，但也可以位于外周组织，包括眼睛和肠道^［

10，19］。本研究中，Y1R在大脑和眼睛中检测到较高的表达量，并在鳃和肠道中也有部分表达。之前的研究表明，Y1R信号通路可刺激金鱼（Carassius auratus）和斑马鱼等硬骨鱼类的食物摄入^{［参考文献 20-22}20-22］。这说明草鱼Y1R可能通过脑肠轴影响摄食调控。此外，在激活Y1R的情况下，NPY在视网膜神经元中具有神经保护作用并激活视网膜神经细胞增殖^{［参考文献 23-24}23-24］，说明草鱼Y1R可能在视网膜中发挥作用。与Y1R相似，草鱼Y2R在鳃、肠道、脑和眼睛有较高的表达。这与大黄鱼Y2R在肠道和脑具有高表达的结果相类似^{［参考文献 14

百度学术}14］，说明Y2R可能在草鱼的食欲调节中发挥重要作用。Y2R也在点带石斑鱼（Epinephelus coioides）的眼睛中有较高的表达水平^{［参考文献 15

百度学术}15］。同时，在对大鼠视网膜细胞的研究中发现，Y2R的激活可抑制视网膜细胞的坏死性死亡^{［参考文献 25

百度学术}25］。这表明Y2R可能在草鱼视网膜中发挥功能。相对于其他组织，Y4R在脑中有较高表达，这与在斑马鱼中的研究一致^{［参考文献 26

百度学术}26］，表明Y4R可能主要在中枢系统发挥作用。Y7R在所检测的组织中表现出分布的广泛性，这与在虹鳟中的研究一致^{［参考文献 27

百度学术}27］。Y8Ra在脑中有较高表达，这与在草鱼和斑马鱼中的研究一致^{［参考文献 13

百度学术}13，26］。与Y2R的表达模式相似，Y8Ra在眼睛和鳃中也有表达，这可能是由于Y2R和Y7R同属Y2亚家族，在组织表达上具有一定的相似性。类似地，Y8Rb在脑和眼睛中的较高表达与在点带石斑鱼中的研究一致^{［参考文献 15

百度学术}15］。这说明Y8Rb可能主要在中枢系统和视网膜中发挥功能。在硬骨鱼类中，鳃同时具有呼吸和渗透调节功能，其中一些功能可以解释Y2R和Y7R在鳃中的高表达。同时Y1R、Y8Ra和Y8Rb也在鳃中有部分表达。这可能是由于这些受体可以介导NPY在鳃中的调节功能。YR表达的组织特异性分布差异可归因于硬骨鱼类物种之间的差异或检测方法的敏感性。基于以上结果，我们推测，YR主要在大多数硬骨鱼类的中枢神经系统和一些外周组织中表达。

1986年，YR家族在药理学上被描述为一种主要的突触前NPY/PYY受体^［

28］。YR对配体的亲和力不同，其中Y1R、Y2R和Y5R对NPY的亲和力较高^{［参考文献 29

百度学术}29］。为了探索不同亚型YR对NPY的响应及其信号通路，本研究在细胞水平上检测了不同亚型YR的功能性表达。本研究发现，在cAMP水平分析中，受到NPY刺激后，HEK293t细胞中表达的Y2R和Y8Rb在功能上与Gi/o蛋白偶联，它们的激活引起cAMP/PKA信号通路的变化。而在对大黄鱼和鸡的研究中，Y2R在受到NPY刺激后也可激活调节cAMP/PKA信号通路^{［参考文献 14

百度学术}14］。在P-ERK分析中，本研究发现NPY可以激活Y4R和Y8Rb，并触发细胞内MAPK/ERK信号级联。而鸡的Y4R在受到NPY刺激后也可激活调节MAPK/ERK信号通路^{［参考文献 30

百度学术}30］。由此推测，与其他受体相比，Y2R、Y4R和Y8Rb与NPY更容易结合并且可以在体外传递信号。

与对照组相比，注射NPY 2 h后Y2R、Y4R和Y8Rb的表达量显著升高，表明Y2R、Y4R和Y8Rb在活体中可对NPY的刺激做出响应，这与上述细胞试验中得出的结果一致。值得注意的是，除Y2R、Y4R和Y8Rb外，Y1R也表现出对NPY的响应。这可能是由于Y1R在体外不能单独被NPY激活，或是活体中存在其他YIR配体。

综上所述，草鱼Y2R、Y4R和Y8Rb在细胞、活体水平均对NPY的刺激具有响应，NPY很可能通过这些受体发挥作用。这些发现不仅有助于全面了解NPY系统在硬骨鱼类中的生理作用，而且有助于揭示YR在不同脊椎动物中结构和功能的变化。

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