摘要
为深入了解哺乳动物卵泡发育的机制，对小鼠卵巢颗粒细胞中干扰素诱导的跨膜蛋白1（interferon-induced transmembrane protein 1，Ifitm1）基因进行超表达和抑制表达分析，通过流式细胞术、荧光定量PCR、EdU法及western blot分析Ifitm1对小鼠颗粒细胞生长的影响及对小鼠排卵相关基因表达的调控作用，并用相关通路抑制剂处理颗粒细胞，探究Ifitm1影响小鼠卵泡发育及排卵的相关机制。结果显示，在小鼠卵巢颗粒细胞中成功地超表达和抑制表达了Ifitm1基因，干扰 Ifitm1基因表达使细胞周期蛋白Ccnd1表达降低了63.5%，G0/G1期细胞占比也下降，使细胞阻滞在G2/M期，从而抑制颗粒细胞增殖；干扰Ifitm1基因还导致排卵标记基因Lhr、Ereg、Cyp19a1表达水平提高了1.95~6.76倍（P<0.05），并抑制PI3K/AKT信号通路上关键蛋白p-AKT（Ser473）的表达，而阻断PI3K/AKT信号通路后再抑制Ifitm1基因表达，Lhr、Ereg和Cyp19a1的mRNA水平则未出现明显改变，说明Ifitm1基因通过抑制PI3K/AKT信号通路活性影响排卵。以上结果表明，Ifitm1基因通过PI3K/AKT通路介导在小鼠颗粒细胞生长以及卵泡排卵过程中发挥重要作用。
卵泡发育过程受到如内分泌激素、免疫、代谢信号以及来自颗粒细胞分泌的因子等多种信号分子的调
IFITM1、IFITM2和IFITM3属于小型干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）家族，其成员能被干扰素（interferon， IFN）诱导并且抵抗病毒感
21日龄雌性昆明小白鼠，10 IU PMSG超排处理48 h后，处死取其卵巢，分离颗粒细胞并进行细胞培养，待细胞生长至80%~90%的汇合度后消化传代，继续培养，以用于后续的超表达和抑制表达试验。
用T4 DNA连接酶将目的基因Ifitm1连接到用XhoⅠ（10 IU/μL）和HindⅢ（10 IU/μL）酶切后的pCMV-N-HA载体上，16 ℃连接过夜，转入DH5α感受态细胞中。将得到的单菌落稀释在400 μL LB液体培养基中，取l μL菌液作为PCR扩增的模板，对菌落PCR扩增产物进行测序。选择测序结果与插入片段符合的菌液进行扩大培养。使用Omega Bio-tek公司的无内毒素小量质粒提取试剂盒提取质粒。siRNA寡核苷酸片段由广州市锐博生物科技有限公司合成（
| 名称 Name | 序列Primer sequences (5’-3’) | 用途 Usage |
|---|---|---|
| si-Ifitm1-1 | CCATCGTCGTCATCGTTGT |
降低目的基因表达量 Reducing target gene expression |
| si-Ifitm1-2 | ACATCAGCTCCCTGTTCTT | |
| si-Ifitm1-3 | CCACAATCAACATGCCTGA | |
| si-NC | UUCUCCGAACGUGUCACG | 对照 Negative control |
采用Life Technologies公司的脂质体Lipofectamine RNAiMAX 和Lipofectamine 3000分别将siRNA和pCMV-HA-Ifitm1转染至mGCs。将mGCs接种于6孔板，细胞生长到80%汇合度左右进行转染；弃去培养液，PBS清洗后，每孔分别加入转染试剂250 μL、OPTI-MEM 1 750 μL；37 ℃ 5% CO2环境中培养6 h后更换为10%胎牛血清培养液，48 h后收集细胞，以便于后续总RNA和蛋白质的提取。
采用Trizol法对转染后的细胞总RNA进行提
名称 Name | 序列（5'-3'） Sequence（5'-3'） | 片段长度/bp Length | 退火温度/℃ Temperture | 用途 Usage |
|---|---|---|---|---|
|
mmu-Lhr- qPCR-F mmu-Lhr- qPCR-R |
GAAGCGAATAACGAGACG GCCAAATCAACACCCTAA | 175 | 53 |
表达分析(目的基因） Expression analysis （Target genes） |
|
mmu-Cyp19a1- qPCR-F mmu-Cyp19a1- qPCR-R |
ACTTCCCTAAGCCCAATG TCTTCACCTGGAATCGTC | 168 | 53 | |
|
mmu-Ereg- qPCR-F mmu-Ereg- qPCR-R |
ACATGGACGGCTACTGCT CTTTGCTCAAGGGTTGGT | 138 | 53 | |
|
mmu-Ifitm1- qPCR-F mmu-Ifitm1- qPCR-R |
GGGTCACCCCACATCTCAACTTCTG CGTATCACCCACCATCTTCC | 180 | 59 | |
|
mmu-Ccnd1- qPCR-F mmu-Ccnd1- qPCR-R |
GCGTACCCTGACACCAATCTC CTCCTCTTCGCACTTCTGCTC | 183 | 61 | |
|
mmu-β-actin- qPCR-F mmu-β-actin- qPCR-R |
GGCACCACACCTTCTACAATG GGGGTGTTGAAGGTCTCAAAC | 180 | 58 |
表达分析（内参基因） Expression analysis（Internal gene） |
细胞转染结束后，使用RIPA裂解液（150 μL/孔）对细胞进行裂解，收集裂解液于1.5 mL离心管，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，收集上清液于PCR管，加入 5×SDS上样缓冲液稀释至1×，95 ℃变性10 min。每孔加入等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后采用湿转法将蛋白转印至PVDF膜。转膜完成后，在5%的脱脂牛奶中37 ℃封闭1 h，然后4 ℃孵育一抗过夜。一抗包括β-actin抗体（AC026，Abclonal，1∶1 000）、LHR抗体（AF9104，Abclonal，1∶1 000）、CYP19A1抗体（A2161，Abclonal，1∶1 000）、EREG抗体（A16372，Abclonal，1∶1 000）、p-AKT-S473抗体（AP0140，Abclonal，1∶1 000）、HA抗体（AB9110，Abcam，1∶4 000）。二抗包括HRP山羊抗小鼠IgG（AS003，ABclonal，1∶3 000）、HRP山羊抗兔IgG（AS014，ABclonal，1∶3 000）。1×TBST清洗条带3次，每次10 min，再用1×TBST稀释二抗，37 ℃孵育1 h后，1×TBST清洗条带3次，每次10 min。于扫膜仪（GE ImageQuant LAS4000 mini）中显影成像，用ImageJ软件量化灰度值，目标蛋白的相对表达量=目标蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值。
调整小鼠卵巢颗粒细胞密度至1×1
按照3×1
采用流式细胞术检测细胞周期，步骤如下：转染24 h后，胰酶消化细胞，离心去上清，加70%乙醇，于-20 ℃固定过夜。PBS清洗细胞后，PI进行染色。用流式细胞仪和Modfit LT软件统计细胞周期百分比。
通过构建小鼠Ifitm1基因的超表达载体pCMV-HA-Ifitm1和Ifitm1干扰片段转染mGCs，从而研究Ifitm1基因在哺乳动物排卵过程中的作用。结果发现，超表达Ifitm1基因后，mGCs中Ifitm1基因mRNA和蛋白表达水平显著上调（P<0.05）（
图1 小鼠颗粒细胞Ifitm1基因超表达和抑制表达
Fig. 1 Overexpression and suppression of Ifitm1 gene in mGCs
A、C：Ifitm1的mRNA水平 mRNA level of Ifitm1；B、D：Ifitm1的蛋白表达水平 Protein level of Ifitm1.*：P< 0.05.
为了进一步确定Ifitm1基因对mGCs周期是否具有调控作用，利用流式细胞术等检测了超表达和抑制表达Ifitm1基因的卵巢颗粒细胞的周期情况。结果显示，与对照组相比，超表达Ifitm1基因的卵巢颗粒细胞各细胞周期占比无明显变化（
图2 Ifitm1基因超表达或抑制表达后小鼠卵巢颗粒细胞周期
Fig. 2 Cell cycle of mGCs with overexpression or suppression of Ifitm1 gene
A、C：细胞周期的细胞量 Cell population of the cell cycle；B、D：周期调控蛋白基因Ccnd1 mRNA水平 mRNA level of Ccnd1. *：P<0.05.
在颗粒细胞中转染siRNA-Ifitm1，对其增殖情况进行探究。结果发现，干扰Ifitm1基因后，颗粒细胞增殖受到抑制，且细胞活力显著降低（
图3 Ifitm1基因抑制表达后小鼠卵巢颗粒细胞的增殖和活力
Fig. 3 Cell proliferation and viability in mGCs treated with si-Ifitm1
A：细胞增殖情况Cell proliferation；B：细胞活力Cell viability；*： P< 0.05.
在发现Ifitm1会影响颗粒细胞生长的基础上，对mGCs进行超表达或抑制表达Ifitm1基因，随后检测排卵标记基因的mRNA和蛋白质的表达水平。结果发现，干扰Ifitm1基因表达后，排卵标记基因Lhr、Cyp19a1和Ereg的mRNA和蛋白表达水平均升高（
图4 超表达或抑制表达Ifitm1基因后卵巢颗粒细胞中排卵相关基因表达
Fig. 4 Ovulation-related gene expression in mGCs treated with pCMV-HA-Ifitm1 or si-Ifitm1
A、C：排卵标记基因mRNA水平 mRNA levels of ovulation marker genes；B：排卵标记基因的蛋白水平 Protein levels of ovulation marker genes； D：相关基因mRNA水平 mRNA levels of related genes.***：P< 0. 001，**：P<0.01，*：P<0.05.
本研究发现干扰Ifitm1基因表达， p-AKT（Ser473）蛋白水平显著降低，而该蛋白在PI3K/AKT信号通路上起到关键作用（
图5 Ifitm1基因通过PI3K/AKT通路影响卵巢颗粒细胞中排卵相关基因表达
Fig.5 Ifitm1 gene affects ovulation-related gene expression via PI3K/AKT pathway in mGCs
A、B、C：排卵标记基因mRNA水平 mRNA levels of ovulation marker genes；D：p-AKT（Ser473）的蛋白质水平 Protein level of p-AKT in mGCs transfected with si-Ifitm1. ***：P<0.001， * ：P<0.05.
颗粒细胞（granulosa cells，GCs）作为卵泡中最重要的体细胞，参与多种激素及生长因子的合成，对卵泡生长发育和成熟起关键作用。GCs 增殖和凋亡的改变都可以破坏卵母细胞的成熟和胚胎发育，从而降低妊娠
LHR作为卵泡发育及排卵过程中重要的信号转导分子，与配体LH结合后激活cAMP/PKA信号通路，进而调控成熟卵泡的破裂及排卵。研究表明，女性的Lhr基因突变失活后，表现出闭经，没有成熟卵泡或黄体等现象。敲除Lhr基因的雌性小鼠卵泡发育停滞在有腔卵泡阶段，无法继续向后发育，最终导致不
PI3K/AKT 信号通路能调控细胞内多种生物学进程，包括卵泡发育成熟与排卵过程等。FSH独立地激活PI3K/AKT通路，并招募14-3-3适配蛋白，影响颗粒细胞的生存和增
综上所述，抑制小鼠Ifitm1基因表达，颗粒细胞增殖比例显著降低；而Ifitm1基因通过抑制PI3K/AKT细胞信号通路活性影响排卵标记基因的表达。本研究揭示小鼠Ifitm1基因调控卵泡排卵的分子机制，可为解析干扰素刺激基因在繁殖过程中的复杂调控机制提供新见解。
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