摘要
为开展油棕油脂代谢调控相关基因鉴定研究，以油棕八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoene desaturase gene，PDS）作为报告基因，探索以病毒载体TRV为载体在油棕胚状体上应用病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）的可能性，并对油棕胚状体VIGS体系的相关参数进行优化。结果显示：以EHA105为菌种、侵染菌液OD600 = 0.5、侵染时间5 min、乙酰丁香酮（AS）质量浓度20 mg/L、共培养48 h、侵染后培养时间为12 d能取得最佳的基因沉默效果。在此基础上，利用优化后的VIGS体系对油棕二酰甘油酰基转移酶基因（diacylglycerol acyltransferase gene，DGAT）进行沉默，取得了预期的基因沉默效果。
油棕（Elaeis guineensis）是棕榈科单子叶植物，棕榈油的产量占世界产油量的36%。油棕能产出棕榈油（plam oil，PO）和棕榈仁油（palm kernel oil，PKO
油棕传统的育种方法过于依赖育种技术人员的多年经验累积及机遇，油棕转基因的研究不仅周期长还具有很大的不确定性，在需要鉴定大量功能基因时难度很大。油棕愈伤组织是不断增长的无组织植物薄壁细胞，能够分化成整株植
病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing， VIGS）利用了插入植物靶基因cDNA片段的病毒侵染植物，进入植株的病毒在复制和转录过程中能够特异性识别靶基因的同源基因mRNA，使同源基因的mRNA降解从而抑制靶基因的表
本研究以热带棕榈实验室诱导分化的油棕胚状体为试验材料，以油棕的EgPDS作为报告基因，建立并优化油棕胚状体VIGS体系，以期为油棕相关基因的功能鉴定奠定基础。
本研究所使用的油棕（Elaeis guineensis）胚性愈伤组织由海南大学热带棕榈实验室诱导，并在26 ℃恒温、相对湿度65%、光照强度400 mol/（
本氏烟烟草（Nicotiana benthamiana）种子由热带棕榈实验室保存，用含蛭石∶营养土=1∶3的土壤进行培育。
pTRV1、pTRV2载体由山东农业大学李媛媛教授惠赠，均为卡那霉素抗性；大肠杆菌DH5α 感受态细胞、农杆菌EHA105、农杆菌GV3101购自维地生物公司；农杆菌LBA4404由热带棕榈实验室保存。
通过生物信息学的比对分析，在油棕基因库中筛选出油棕的PDS基因EgPDS，在其开放阅读框中选取300 bp的特异性片段，设计引物（上游引物为5´-CGGAATTCTCATTGGGTGGTGAAGTCCG-3´，下游引物为5´-GGGGTACCACTCAAAAG AGGGCTCCTGC-3´），以限制性内切酶KpnⅠ、EcoRⅠ分别双酶切PCR克隆产物和病毒链pTRV2，以 T4 连接酶将2条线性化片段连接为完整的表达载体。将测序结果正确的质粒转入大肠杆菌备用。
将构建好的植物表达载体质粒用冻融法分别转化农杆菌（EH105、GV3101、LBA4404）。用LB培养液分别扩大培养pTRV1、pTRV2、pTRV2-EgPDS，离心收集农杆菌菌体后，加入农杆菌重悬液调节菌液使 OD600 = 0.5。将等体积的pTRV1、pTRV2与pTRV1、pTRV2-EgPDS混合，黑暗静置3~5 h ，随后进行侵染转化。以接种pTRV1、pTRV2-EgPDS农杆菌组为对照组，以接种pTRV1、pTRV2空载农杆菌组为处理组，每个处理接种8块胚性愈伤组织作为1次重复，共设3次重复。将处理后有伤口的胚性愈伤组织在农杆菌侵染液中浸泡后，转移至共培养植物培养基中（含 100 μmol/L的乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和100 mg/L的半胱氨酸），19 ℃暗培养。暗培养后将其转移到继代培养基中，在 28 ℃温度下培养。培养期间淘汰长势不好及死亡的胚性愈伤组织，存活下来的转基因胚性愈伤组织用于后续试验。
为了获得更高的侵染效率，对转化过程中的关键因素进行梯度设置：时间梯度为5、10 min，菌液浓度梯度为OD600 =0.5、1.0、1.5，设置共培养时间为48、72、96 h，选用3个根癌农杆菌菌株：LBA4404、EHA105、GV3101；设置AS质量浓度为10、15、20、25 mg/L；侵染后胚性愈伤组织取样时间在第8、10、12、14天；设置有无烟草介导的转化试验。
定量获得对照组（WT）和试验组胚性愈伤组织cDNA。以油棕保守基因 Egβ-actin为内参，使用 TaKaRa 公司 TB Green qRT-PCR 试剂盒，对油棕胚性愈伤组织中EgPDS 的表达情况进行实时荧光定量检测。试验中每个样品设置3个平行，采用Excel软件进行数据处理。
常规农杆菌介导的转化体系中使用MES重悬缓冲液，本研究基于油棕胚性愈伤组织的敏感性，设置2组试验，一组用MSO 液体培养基悬浮农杆菌进行侵染，另一组采用常规农杆菌侵染液。侵染14 d后取样观察，发现MES试验组无明显表型变化（
图1 初步建立的油棕VIGS体系结果
Fig.1 Experimental results of preliminary establishment of oil palm VIGS system
A：MES处理组：侵染前（左）和侵染14 d后的胚性愈伤组织（右）； B：MSO处理组：侵染前（左）和侵染14 d后的胚性愈伤组织（右）； C：2种处理的胚性愈伤组织中EgPDS的表达量； D：2种处理对胚性愈伤组织转化率的影响。A：Embryoid callus of MES treatment group，before infection（Left）and embryoid callus after 14 days of infection（Right）； B：Embryoid callus of MSO treatment group，before infection（Left） and embryoid callus after 14 days of infection（Right）；C：Expression of EgPDS in embryoid callus treated with two different treatments； D： Effects of two different treatments on embryogenic callus transformation.
1） 侵染浓度、侵染时间对侵染效率的影响。设置侵染时间梯度为5、10 min，菌液浓度梯度为OD600 = 0.5、1.0、1.5，分6组处理进行侵染转化。其中OD600 = 1.5、10 min组与OD600 = 1.0、10 min组无法抑制农杆菌生长，胚性愈伤组织由于与农杆菌共生时间过长缺氧软腐，无法取样分析。对剩余4组进行观察、取样，发现当菌液浓度为OD600 = 0.5、侵染时间为5 min时，转化效率最高，为54.17%（
图2 侵染的菌液浓度与时间（A）、共培养时间（B）、烟草介导（C）、不同农杆菌菌株（D）、AS浓度（E）、培养时间（F）对油棕的VIGS体系转化效率的影响
Fig. 2 Effects of concentration and time （A）， co-culture time （B）， tobacco-mediated （C）， different agrobacterium strains （D）， concentration of AS （E） and culture time （F） on the transformation efficiency of oil palm VIGS system
2） 共培养时间对侵染效率的影响。将共培养时间分别设置为48、72、96 h，除了共培养时间外所有的操作保持一致，14 d后对每组胚性愈伤组织进行取样分析，发现转化效率随着共培养时间增加而降低，共培养48 h组转化效率最高，为86.67%（
3） 有无烟草体系介导对侵染效率的影响。以烟草作为扩繁介导，用注射病毒的烟草汁液混合物，侵染接种油棕胚性愈伤组织；同时做1组无烟草介导的侵染试验。观察发现烟草叶片带来的微生物影响无法忽略，常因为霉菌的生长影响到胚性愈伤组织的正常生长进而影响到胚性愈伤组织的存活率，降低胚性愈伤组织的转化率（
4） 不同农杆菌菌株对侵染效率的影响。由于农杆菌介导的转化体系具有明显的宿主局限性，选取目前实验室应用最广泛的3种根癌农杆菌菌株：LBA4404、EHA105、GV3101作为备选菌种进行油棕胚性愈伤组织的侵染转化筛选。结果（
5）AS质量浓度对侵染效率的影响。在侵染的MSO液体培养基中分别加入10、15、20、25 mg/L的AS，进行转化，发现转化效率随着AS质量浓度的增加而提高，当AS质量浓度为20 mg/L时转化效率最高；但AS质量浓度为25 mg/L时转化效率反而降低（
6） 培养时间对侵染效率的影响。研究发现14 d的侵染对胚性愈伤组织损伤严重，导致油棕胚性愈伤组织存活率及转化率变低。对侵染后的胚性愈伤组织在第8、10、12、14天分别进行取样，分析发现第12天侵染效果最好，且胚性愈伤组织生长状态良好（
在最优条件下，即侵染菌种为EHA105、以MSO作为重悬液、侵染菌液OD600 = 0.5，侵染时间为5 min、侵染液中AS质量浓度为20 mg/L、共培养48 h、侵染后的培养时间为12 d时，利用油棕基因EgDGAT1转化油棕胚性愈伤组织，提取样品RNA进行实时定量PCR检测，发现与对照组相比，试验组的EgDGAT1表达量显著下调（
图3 油棕胚性愈伤组织中EgDGAT1表达量的检测
Fig. 3 Detection of EgDGAT1 expression in oil palm embry-type callus of experimental group and control group
VIGS技术具有无需遗传转化、无品种依赖性、简单高效等优点，对于植物基因的功能研究有着重要参考价
在单子叶植物的侵染过程中，AS的添加及浓度就显得尤为重要，本研究发现当AS质量浓度为20 mg/L时转化效率最高。共培养时间在农杆菌转化过程中是关键的一环，研究表明，农杆菌在植物体受伤部位附着16 h后才会进行诱导转移，不同植物对共培养的最佳时间要求也不
与其他含油量丰富的大豆、花生等1年生油料作物相比，作为油料木本作物的油棕的基因功能鉴定研究进展非常缓慢，因此，构建一个可以迅速、高质量鉴定油棕基因功能的体系就显得格外重要。VIGS的显著优点是研究基因功能时周期较短，常规遗传转化验证基因功能时常需要植物生长至F2甚至F3代时才能开展研究，本氏烟及番茄在20 ℃的状态下20 d左右就可以观察到明显的白化表
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