摘要
为研究MCHK_7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮中的功能，用同源重组的方法构建了MCHK_7135基因的突变体及回补菌株，对突变菌株和回补菌株在人工培养条件以及与宿主植物紫云英共生下的各项表型进行了考察，结果显示：与野生型菌株相比，突变菌株对氧胁迫的敏感性增强；接种突变株的紫云英长势矮小，侵染线及根瘤原基数目减少，根瘤数量少，固氮酶活性低，而向突变菌株导入完整MCHK_7135基因后，各项共生表型得到不同程度恢复。研究结果表明，华癸中慢生根瘤菌的过氧化物还原酶基因MCHK_7135基因在根瘤菌与宿主植物共生固氮的过程中具有重要功能。
在自然界，根瘤菌在土壤中单独存活称为根瘤菌的自生状态，不具有固氮能力。当根瘤菌侵染豆科植物根系，与豆科植物共生形成根瘤后，根瘤菌在根瘤中分化为类菌体（bacteroid）形式，进而行使固氮功能，这是根瘤菌的共生状
在前期工作中，笔者所在的生物固氮课题组以与紫云英共生的华癸中慢生根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）7653R为研究对象，用RNA-Seq和Microarray技术分别对根瘤菌在自生状态以及共生状态下的样品进行了转录组测序，分析了根瘤菌在自生和共生状态下差异表达基因，获得了若干显著差异表达基
为探究该基因在共生固氮中的功能，本研究采用同源重组双交换的方法构建了华癸中慢生根瘤菌7653R的MCHK_7135基因突变体菌株和回补菌株，考察该菌株接种宿主植物紫云英后的共生固氮表型，以期为深入研究该基因在根瘤菌类菌体发育和共生固氮中的功能提供科学依据。
紫云英（Astragalus sinicus）种子：信紫1号，河南省信阳市农业科学院提供。菌株：笔者所在实验室保存的野生型华癸中慢生根瘤菌7653R菌株，大肠杆菌E. coli DH5α。质粒：蔗糖敏感型自杀质粒pJQ200SK（G
限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Fermentas公司和TaRaKa公司，PCR反应相关试剂、琼脂糖凝胶电泳Marker购自东盛生物科技有限公司， PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海华舜（Watson）生物公司，抗生素、培养基相关组分等分子生物学常规药品及试剂均购自中国国药集团。FAA固定液购自武汉谷歌生物科技有限公司。研究所用PCR引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成，DNA的测序工作由北京华大基因公司和南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1）根瘤菌MCHK_7135基因突变菌株的构建。首先利用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension， SOE-PCR）的方法构建基因突变所需的置换载体（
图 1 SOE-PCR设计方案
Fig. 1 Scheme of SOE-PCR
引物名称 Primer name | 序列Sequence(5´-3´) |
|---|---|
| SOE-B | GCTCTAGACAAAGTCCGAAAATCGCGTC |
| SOE-C | ACGGAGAAATTTGATGACCGCAAAGCCACGTTGTGTCT |
| SOE-D | TTTGAATGACCTCACCGGACAGAAAAACTCATCGAGCA |
| SOE-E | AGACACAACGTGGCTTTGCGGTCATCAAATTTCTCCGT |
| SOE-F | TGCTCGATGAGTTTTTCTGTCCGGTGAGGTCATTCAAA |
| MCHK_7135-F | GCTCTAGATAACTAGATGAGAGGAGGAATTTGATGACCGGTC |
| MCHK_7135-R | GCTCTAGAAGCTTTGCCCTTGTG |
测序正确的片段构建到含有蔗糖敏感基因sacB的pJQ200SK（G
将含置换载体的大肠杆菌、根瘤菌、辅助菌E. coli pRK2073进行三亲本杂交，在含Km的根瘤菌合成培养基SM上筛选出获得了置换载体的的根瘤菌株（K
2）根瘤菌MCHK_7135回补菌株的构建。先构建含有MCHK_7135完整ORF的回补载体，在引物序列（引物MCHK_7135_F 和 R，
首先将M. huakuii 7653R的野生型、突变株、回补菌株分别在TY液体培养基中培养，检测它们在无胁迫环境中的生长能力。再分别培养到对数期，离心收集等量菌体，生理盐水清洗后，分别用终浓度为0、0.1 和 1.0 mmol /L 的 H2O2于 28 ℃处理 1 h，用生理盐水洗去H2O2 后，稀释涂TY平板，每种浓度 5 个重复。28 ℃ 培养 3 d，计算菌落数。
紫云英种子用5%（V/V）NaClO表面消毒10 min，无菌水洗涤10~15次后，平铺在1%~2%的水琼脂上，28 ℃培养 2 d，使种子发芽。发芽种子栽培于灭菌的沙钵中。在18~22 °C光照培养室培养，浇灭菌的 Fahraeus无氮营养液，16 h光照/8 h黑暗培养6 d后，接种根瘤菌，根瘤菌用TY液体培养48 h，离心后无菌水悬浮，每钵接种2 mL。
为便于观察共生早期的侵染线，通过两亲本结合转移方法对根瘤菌标记绿色荧光蛋白基因（gfp），分别向M. huakuii 7653R的野生型、突变体、回补菌株导入含有gfp基因的质粒pMP2463（G
将gfp标记的野生型、突变株、回补菌株分别接种盆栽紫云英。依次在接菌后4 、8 、14 d收获根系，在荧光显微镜下（405 nm）观察根瘤菌侵染线、根瘤原基的激发荧光。
我们的前期研究显示，MCHK_7135位于华癸根瘤菌7653R菌株的pMHa共生质粒上（GenBank：WP_038654552）。该基因开放阅读框架（ORF）有534 bp，编码1个由177个氨基酸残基组成的蛋白质（
图 2 根瘤菌 MCHK_7135基因的DNA及氨基酸序列
Fig.2 DNA and amino acid sequence of MCHK_7135 in rhizobium
图3 NCBI网站对MCHK_7135蛋白保守结构域的分析
Fig. 3 Conserved domains analysis of MCHK_7135 peptide
图4 MCHK_7135基因系统发育树
Fig.4 The phylogenetic tree of MCHK_7135 gene
1）MCHK_7135基因突变菌株构建。首先用重叠延伸PCR（ SOE-PCR）构建同源双交换所需的目的基因失活片段，即被卡那霉素基因插入的MCHK_7135片段（MCHK_7135：：Km）。再将之构建到含有蔗糖敏感基因SacB的pJQ200SK（G
利用三亲本结合转移技术，将置换载体pJQ200SK（MCHK_7135：：Km）导入野生型M. huakuii 7653R中。挑取在SM+Km培养基上生长的转化子接种在含蔗糖的TY培养基上，由于pJQ200SK含有SacB基因，是蔗糖敏感型自杀质粒，在含蔗糖的培养基中因不能复制而丢失，而质粒上MCHK_7135：： Km片段则会以一定频率和野生型根瘤菌上的MCHK_7135 DNA序列发生同源交换。用不同浓度的蔗糖进行筛选，最终获得同源双交换的突变株。得到的突变株只能在含有抗生素Km的SM平板上生长，在SM+Gm上不生长。说明其pJQ200SK载体已经丢失，而含Km的目的基因片段已经通过同源双交换，替换了染色体上原有的野生型MCHK_7135基因序列。
2）MCHK_7135基因回补菌株的构建及筛选。为了验证突变菌株与紫云英的共生表型变化是否由于目的基因失活所引起，需要构建回补菌株：以野生型根瘤菌 gDNA为模板，扩增出的MCHK_7135全长克隆到表达载体pBBR1MCS5上，构建成回补载体pBBM1MCS5+7135。三亲本结合转移导入∆7135突变株，获得回补菌株M. huakuii 7653R∆7135+C。
1）无胁迫条件下，M. huakuii 7653R的野生型、突变株、回补菌株的生长情况。3种菌株活化培养到对数期后，分别等量接种到TY液体培养基中28 ℃振荡培养，定期取样测OD600 值。结果显示：3种菌株的生长速度相似，表明在正常培养条件下，MCHK_7135基因缺失不影响根瘤菌株的生长（
图 5 各根瘤菌株在液体培养基中的生长曲线
Fig.5 Growth curve of each rhizobium strains in liquid medium
WT：野生型根瘤菌 Wild-type rhizobium strain； Δ7135：突变株Δ7135 mutant strain； Δ7135+C：回补菌株Δ7135 mutant strain complemented with complete MCHK_7135 gene。误差线表示3个重复的标准差。Error bar represent the mean± SD for 3 replications. 下同。The same as follows.
2）在H2O2胁迫条件下，M. huakuii 7653R的野生型、突变株、回补菌株的生长情况。3种菌株经终浓度为0、0.1、0.5 和 1.0 mmol/L的 H2O2处理后，稀释涂布TY平板，结果显示，在没有H2O2胁迫时（0 mmol/L），各菌株的生长没有明显差异；在 H2O2胁迫处理后，MCHK_7135突变株对氧胁迫更为敏感，其存活率下降的程度显著大于野生型和回补株，说明MCHK_7135基因有助于根瘤菌抵御氧胁迫（
图 6 各根瘤菌株经H2O2胁迫处理后在TY平板上的菌落数
Fig.6 The colony number of each strains on TY plate after H2O2 stress treatment
*：有显著性差异（P<0.05），**：有极显著性差异（P<0.01）。下同。*：Significant difference，P<0.05； **： very significant difference， P<0.01.The same as follows.
将标记了gfp荧光基因的野生型根瘤菌、突变株、回补菌株分别接种盆栽紫云英。分别在接菌后4、8、14 d收获根系，在荧光显微镜下观察GFP标记的侵染线和根瘤原基（
图 7 GFP标记的侵染线和根瘤原基
Fig.7 Infect thread and nodules primordium labeled by GFP（bar=100 μm）
图8 各根瘤菌株的早期侵染事件数据
Fig.8 Data of early infect event by each rhizobium strains
A： 接菌后不同时期，各菌株形成的侵染线统计； B： 接菌14 d后的根瘤原基统计。A： The infect thread by each rhizobium strains in vary days after inoculation； B： The nodule primordium number by each rhizobium strains in 14 dpi.
由
接菌14 d（14 dpi）后形成的根瘤原基形态和数量统计结果显示，接种突变菌株14 d后形成的根瘤原基数量显著少于野生型（
以上结果表明：MCHK_7135突变失活后，对根瘤菌早期侵染有一定影响，特别是对根瘤原基形成的影响较大。
相较于接种野生型M. huakuii 7653R的紫云英，接种∆7135突变株的紫云英长势矮小、瘤数偏少、体积较小、颜色偏白；回补突变株所结根瘤体积比突变株大，颜色为桃红色，紫云英植株长势正常，接近野生型（
图 9 接种根瘤菌各菌株30 d后，盆栽紫云英的全植株、根系表型
Fig.9 Whole plant and root phenotypes of A. sinicus inoculated by vary rhizobium strains for 30 days
A：野生型根瘤菌； B：Δ7135突变株； C：Δ7135+C 回补菌株； D：不接根瘤菌对照。A：Inoculated with wild-type rhizobium strain； B： Inoculated with Δ7135 mutant strain； C：Inoculated with Δ7135+C complement strain； D： None-inoculated as control.
数据分析结果显示，与野生型相比，接种∆7135突变株的紫云英植株鲜质量显著偏低（
菌株 Strain | 单株地上部鲜质量/g Fresh weight aboveground part per plant | 根瘤数 Nodules number | 单株根瘤质量/mg Weight of root nodule per plant | 固氮酶活（C2H4）/(μmol /h) Activity of nitrogenase |
|---|---|---|---|---|
| WT | 0.179 ±0.003a | 18.44 ±0.59a | 13.02 ±0.70a | 11.21 ±0.027a |
| ∆7135 | 0.110 ±0.150b | 11.34 ±1.77a | 7.60 ±1.05b | 5.20 ±0.109b |
| ∆7135+C | 0.168 ±0.016a | 14.88 ±4.03a | 10.41 ±0.64a | 8.01 ±0.425a |
| CK | 0.120 ±0.026b | 0 | 0 | 0 |
注： CK：不接根瘤菌的紫云英对照。表中数据为5个重复的平均值，每列数据中有相同字母表示没有显著差异（P<0.05）。Note：CK：A. astragalus without rhizuobium。 The data is average of 5 replicates. Data in each column followed by the same letter are not significant difference （P<0.05）.
共生表型统计结果表明，MCHK_7135基因突变失活后，显著降低了根瘤菌的结瘤和固氮能力。与野生型相比，回补菌株∆7135+C在每株紫云英上所结根瘤的数和固氮酶活性都没有显著差异。回补菌株接种的紫云英鲜质量、根瘤质量虽比野生型降低，但均高于突变株（
接菌30 d后收获根瘤，制备石蜡切片，用苯甲胺蓝染色，结果显示：和野生型M. huakuii 7653R相比，∆7135突变株的根瘤尺寸偏小，根瘤内含有类菌体的植物细胞（染成蓝色的细胞）比例较少，且多数含菌的根瘤细胞内有大的空泡。回补株的根瘤表型接近野生型根瘤（
图 10 接种根瘤菌30 d后的根瘤石蜡切片
Fig. 10 Paraffin section of nodule after inoculated with rhizobium for 30 days
生物在生理代谢中会产生一些活性氧类物质（reactive oxygen species， ROS），包括超氧阴离子（O
在病原微生物或根瘤菌侵染宿主植物时，宿主植物会产生活性氧物质作为防御机制，而根瘤菌体内的相关酶类表达会被激活，从而保护根瘤菌的侵染过
对豌豆根瘤菌的研究
对根瘤菌的研究表明，过氧化物还原酶在保护根瘤菌侵染、类菌体发育、固氮酶正常固氮方面起着重要作
本研究首先构建了华癸中慢生根瘤菌的过氧化物还原酶MCHK_7135基因突变菌株，在自生条件下，Δ7135菌株对H2O2胁迫的敏感性显著增强，说明MCHK_7135失活后，根瘤菌更容易受到过氧化物毒害。接种紫云英之后，突变株的结瘤数量和固氮能力都显著低于野生型菌株，说明过氧化物还原酶基因MCHK_7135对于根瘤菌类菌体发育以及根瘤的固氮功能都起重要作用。过氧化物还原酶基因的失活，将导致根瘤菌侵染宿主时，宿主产生的防御机制不能被解除，根瘤菌不能在宿主植物根系正常定殖，进而影响结瘤和固氮。本研究探讨了华癸根瘤菌的MCHK_7135作为过氧化物酶基因在根瘤菌侵染、结瘤、固氮中的作用，下一步将研究该基因在根瘤中抗氧化胁迫的分子机制和基因调控机制。
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