摘要
为有效防控枣树干腐病，以47株不同来源的枣树干腐病斑分离物为材料，采用ITS和EF-1α基因序列比对分析以及室内接种方法，对枣树干腐病病原菌进行鉴定，并分析其分布特点及致病力差异。结果显示，47株不同来源的枣树干腐病病原菌包括葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、希氏座腔菌（Spencermartinsia viticola）、平截色二孢（Diplodia mutila）、色二孢菌（D. seriata）和火炬树暗葡腔菌（Phaeobotryon rhois）5个种，其中，S. viticola的分离频率最高，约65.96%，B. dothidea的分离频率次之，为17.02%；河南和河北的优势病原菌分别为葡萄座腔菌（B. dothidea）和色二孢菌（D. seriata），山西、甘肃和宁夏的优势病原菌均为希氏座腔菌（S. viticola）；枣树干腐病的5种病原菌中B. dothidea的致病力最强，P. rhois的致病力最弱；病原菌S. viticola在山西和河北的分离株致病力较强，在河南、宁夏和甘肃的分离株致病力较弱。以上研究表明，枣树干腐病的病原主要由5种葡萄座腔科的真菌组成，不同地域的优势病原菌存在差异；此外，不同地区的同种病原菌的菌株间致病力存在差异，同一地区的不同种病原菌株间的致病力也有差异。
枣树干腐病主要危害枣树的枝条，在枣树的树体主枝上面产生圆形颜色较深的病斑，1998年在山西省首次报道该病
1）供试病原菌。47株分离自枣树干腐病病斑的分离株的来源与分布如
菌株代号 Strain code | 菌株数量 Number of strains | 来源 Source of strain |
|---|---|---|
| HN | 8 | 河南 Henan |
| HB | 9 | 河北 Hebei |
| SX | 8 | 山西 Shanxi |
| GS | 11 | 甘肃 Gansu |
| NX | 11 | 宁夏 Ningxia |
2）主要试剂。DNA Marker（DL2000）、2×Taq PCR Master Mix、琼脂糖凝胶回收试剂盒等，分别购自宝生物技术（北京）有限公司（TaKaRa）、艾德莱生物科技有限公司（北京）和axygen公司。
将实验室保存的菌株在PDA平板上活化，28 ℃黑暗培养3~5 d后，用打孔器在菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，转至铺有玻璃纸的PDA平板上，待其长满培养皿，刮取菌丝保存至-80 ℃冰箱备用。
为观察不同种类病原菌的形态差异，选取鉴定后的5种代表性菌株，在PDA平板28 ℃黑暗培养3~5 d后，观察菌落形态，并拍照。
供试菌株基因组总DNA的提取采用CTAB
将测序结果在NCBI中进行Blast比对分析，用Clustal X（2.0）软件分别对所获得的rDNA-ITS和EF-1α基因序列进行多重序列比对分析。用FASconCAT将rDNA-ITS和EF-1α基因序列进行序列拼接，通过MEGA7建树软件构建系统发育树，用Saccharata proteae strain CBS 115206作为外群。
为分析枣树干腐病不同种类菌株差异情况，选取5个种的代表性菌株进行致病力测定，分析不同种类病原菌的致病力。为比较不同地区菌株之间致病力差异，从5个地区及5个种中选取2个及以上地区共有的10个不同的菌株，以枣树1年生枝条为试验对象进行不同地区同种病原菌及同一地区不同病原菌致病性测定试验，分析不同地区之间枣树干腐病病原菌的致病力差异。
致病力测定的枣树和枣果采集于新郑市枣园，品种为冬枣（Ziziphus jujuba cv. Dongzao）。将采集的1年生枣树枝截成10~12 cm的小段，先用70%的乙醇浸泡的脱脂棉反复擦拭进行表面消毒，再用无菌水漂洗2~3次，晾干后，将融化的石蜡封闭形态学上端截面，灭菌的含水脱脂棉封闭下端截面。使用灭菌处理的打孔器在枝条上打孔，分别将1个病原菌菌饼的菌丝面贴在接种孔部位，菌饼背面贴上无菌水润湿的脱脂棉，接种后的枝条置于消毒的托盘里，用保鲜膜包被托盘，28 ℃恒温生化培养箱中培养7~9 d后，测量病斑长度并拍照（拍照前用刀片刮除枝条表皮），以接种不含病原菌的培养基为对照。每处理3个枝条，试验重复3次。
鲜枣果接种试验采用针刺接种法，将采摘的新鲜枣果用自来水冲洗、吸水纸擦拭干净后，用70%的乙醇表面消毒3~5 min，再用无菌水清洗2~3次，自然晾干，用灭菌的接种针穿刺枣果的表皮，接种方法与枝条接种相同，28 ℃恒温培养箱中培养3 d后，观察病斑大小并拍照（拍照前用刀片纵向切除接种部位坏死组织），以接种PDA培养基为对照。每次试验各处理3个枣果，重复3次。
致病力测定完成后，按照组织分离法从发病部位分离病原菌，并进行形态观察，完成柯赫氏法则的验证。
供试病原菌分离株的系统进化树如
图1 基于rDNA-ITS和EF-1α基因序列构建的供试病原菌系统进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree of test pathogens based on rDNA-ITS and EF-1α sequences
5个种的代表菌株菌落形态差异明显：B. dothidea菌株菌落呈均一白色菌丝，边缘整齐，气生菌丝浓密；S. viticola菌株菌落同心圆状，边缘菌丝白色，较稀疏，中部菌丝较致密，内部菌丝有黑色色素，少量气生菌丝；D. seriata菌株菌落呈均一白色，边缘菌丝稍稀疏，中部存在较致密的气生菌丝；D. mutila菌株菌落同心圆状，均一白色菌丝，边缘稀疏，中部较致密，少量气生菌丝；P. rhois菌株边缘菌丝齐整但十分稀释，中部菌丝不齐整致密（
图2 5种代表性分离菌株的菌落形态
Fig. 2 The colony morphology of five represent strains
供试的分离株在不同地区的分布如
图3 不同地区分离株的分布
Fig.3 The distribution proportion of isolates in different areas
HN、HB、SX、GS和NX分别代表河南、河北、山西、甘肃和宁夏，下同。 HN， HB， SX， GS and NX represent Henan， Hebei， Shanxi， Gansu and Ningxia， respectively.The same as below.
5个种的代表菌株致病力检测结果表明，5株供试分离株均可以引起枣树枝干和果实发生褐色坏死，接种枝条接种处出现近椭圆形的褐色的水渍状病斑，且病斑边缘处颜色偏深；接种鲜枣果接种处表皮出现圆形深褐色的病斑，由病斑处横切后，果肉呈现近圆形的浅褐色病斑，病斑呈腐烂坏死状。5种枣干腐病病菌中，B. dothidea的致病力最强，其次是S. viticola，P. rhois的致病力最弱（
图4 供试分离株的致病性
Fig.4 Pathogenicity of the tested isolates
A：枣树1年生枝条接种处理；B：鲜枣果接种处理。 A： Annual jujube branches inoculation treatment； B： Fresh jujube fruit inoculation treatment. 1：CK； 2： B. dothidea；3： S. viticola；4：D. mutila；5：D. seriata；6：P. rhois.
不同地区的病原菌致病力检测结果表明，10株供试分离株均可以在不同程度上引起枣树枝干褐色坏死，接种枝条接种处出现近椭圆形的褐色的病斑，且病斑边缘处颜色较深。S. viticola在不同地区分离出来的分离株致病力差异较小，但依然可以看出明显的差距，山西和河北的该病原菌致病力较强，河南、宁夏和甘肃的分离株致病力较弱。B. dothidea和D. mutila在不同地区分离出来的分离株致病力差异较大。同一地区中，河北地区的分离株数量最多，但不同种的病原菌的菌株之间致病力有较大差异，其中D. mutila的致病力最强，B. dothidea致病力最弱。在河南地区的分离株中，不同种病原菌之间致病力的差异较大，优势种B. dothidea的致病力远远强于S. viticola。山西和宁夏的不同分离株之间致病力差异较小。因此，虽然这5种病原菌均可以引起枣树干腐病，但是不同地区同种病原菌及同一地区不同病原菌致病力结果之间存在一定的差异（
图5 不同地区和不同种分离株的致病性
Fig. 5 Pathogenicity of isolates from different regions and different species
A：不同地区同一种病原菌接种处理； B：不同种同一地区的病原菌接种处理。 A： The same pathogen from different areas inoculation treatment； B： Fresh jujube fruit inoculation treatment. MOCK：Control；Sv：S. viticola；Bd：B. dothidea； Dm：D. mutila；Ds：D. seriata；Pr：P. rhois.
葡萄座腔菌科（Botryosphaericeae）真菌是一类引起林木和果树溃疡、茎枯、枝枯等多种病害的植物病原
虽然这5种葡萄座腔菌科病原菌均可以引起枣树干腐病，但是不同地区同种病原菌及同一地区不同病原菌致病力结果之间存在一定的差异，就致病力最强的B. dothidea来说，虽然该种的葡萄座腔菌致病力均较强，但河南的分离株和河北的分离株之间致病力仍有差距。不同种葡萄座腔菌分布最广的河北地区，不同种之间致病力也有明显差异。
葡萄座腔菌科及其相关类群历经不同分类单元的变化，广义的葡萄座腔菌类真菌包括以葡萄座腔菌科为主的葡萄座腔菌目中的相关类
本研究从5种病原菌的地理分布来看，除河北的枣树干腐病菌有4种病原菌外，其他地区的病原菌仅有2种（河南、山西、宁夏）或1种（甘肃）。表明不同地域的枣树干腐病病原菌组成不同，其优势病原菌也存在一定的差异。这差异的成因可能与地区不同的地理环境、栽培技术和气候条件等差异有关。枣树干腐病发病初期不易发现，5~10 a左右仅在树干形成小洞，20 a左右树液在生长季节外溢，造成树干纵向破腹，形成树洞，病症才得以显
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