摘要
为探究诃子在畜禽疫病防控中的作用及应用潜力，以大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌3种常见致病菌为对象，对比诃子和其他11种中药提取物的抑菌圈直径和最小抑菌浓度（MIC），分析诃子培养上清液的总漏出率和电导率、蛋白浓度及诃子对细菌DNA和蛋白含量的影响。结果显示：诃子比其他11种中药的抑菌效果更强，表现为抑菌圈直径更大，MIC更低。培养上清液的电导率和漏出率增加，用2倍 MIC诃子药液处理8 h后，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌上清液蛋白浓度显著增加（P<0.05）。诃子抑制大肠埃希菌蛋白合成，使分子质量约为80 ku的蛋白缺失；对肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌蛋白质合成影响不明显，对细菌DNA也没有明显的凝胶阻滞作用，但能降解DNA。以上结果表明：诃子具有较好的抑菌效果，其作用机制是通过破坏细菌细胞膜通透性，抑制细菌核酸和蛋白合成而发挥抑菌作用。
大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌是常见的革兰氏阴性
中药在我国有悠久的历史，由于其易获得、残留少、不易产生耐药性的优点，成为治疗耐药菌感染的理想药
本试验采用的中药醇提取物（10∶1）为固体粉末，包括连翘、诃子、苦参、黄连、五味子、紫花地丁、金银花、苏木、乌梅、女贞子、蒲公英、黄芪共12种，均购自陕西文迪生物科技有限公司；MH肉汤、NA琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司；Bradford法蛋白浓度检测试剂盒、空白药敏纸片，购自北京索莱宝科技有限公司；细菌总蛋白提取试剂盒，购自北京庄盟国际生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司；考马斯亮蓝染色液（G-250）和蛋白预制胶试剂盒，购自兰杰柯科技有限公司。
取本文“1.1”中12种中药提取物各4 g，分别溶于20 mL无菌水中制成0.2 g/mL的药液，水浴锅加热溶解后，置于121 ℃灭菌锅灭菌15 min，4 ℃保存，备用。
划线复苏冻存大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌菌株，分别挑取单菌落于MH肉汤培养基37 ℃、220 r/min培养16 h，调整各菌悬液浓度分别为1×1
1） 抑菌圈。采用药敏纸片扩散
2） 最小抑菌浓度（MIC）。用二倍稀释
依据比色法测定诃子培养上清液的总漏出率（OD600 nm）和培养液电导率（OD450 nm）相对
细菌培养液蛋白浓度用Bradford
取3种菌液各500 μL（终浓度为1×1
分别加入诃子提取物药液至终浓度为1倍、2倍和4倍MIC 2 mL，ddH2O为阴性对照，菌液2 mL，37 ℃培养8 h，用细菌总蛋白提取试剂盒提取胞内蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。每个样品取16 µL加入4 µL蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min，冷却至室温，吸取15 µL上样，电压80 V，当样品到达分离胶边缘时加压至120 V，直至样品移动至距胶底端1 cm结束，取下胶板，染色，脱色完全后置于凝胶成像系统进行观察。
用改良的凝胶阻滞方
比较12种中药提取物对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的抑菌圈直径测量结果（
中药提取物 Chinese herbal extract | 大肠埃希菌 Escherichia coli | 肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae | 阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae |
|---|---|---|---|
| 诃子 Terminalia chebula | 8.53±0.34 | 8.61±0.35 | 8.51±0.42 |
| 乌梅 Fructus mume | - | 8.10±0.65 | 7.95±0.89 |
| 黄连 Coptis chinensis | - | 7.30±0.29 | - |
| 五味子 Schisandra chinensis | 7.13±0.24 | 7.30±0.43 | 8.70±0.37 |
| 蒲公英 Taraxacum mongolicum | 7.19±0.36 | 7.27±0.24 | 6.73±0.33 |
| 女贞子 Fructus Ligustri | 7.03±0.25 | 7.39±0.28 | 7.50±0.75 |
| 金银花 Lonicera japonica | 6.20±0.16 | 6.87±0.09 | 6.40±0.16 |
| 苏木 Caesalpinia sappan | - | 7.83±0.24 | 6.37±0.29 |
| 连翘 Forsythia suspensa | - | 7.07±0.82 | 6.63±0.42 |
| 紫花地丁 Viola philippica | - | 7.50±0.45 | - |
| 苦参 Sophora flavescens | - | 7.60±0.08 | - |
| 黄芪 Astragalus memeranaceus | - | - | 7.25±0.05 |
注： -表示抑菌效果不明显。Note： - indicates that the antibacterial effect is not obvious.
比较12种中药提取物对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的最小抑菌质量浓度（MIC）（
中药提取物 Chinese herbal extract | 大肠埃希菌 Escherichia coli | 肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae | 阴沟肠杆菌 Enterobacter cloacae |
|---|---|---|---|
| 诃子 Terminalia chebula | 6.25 | 12.50 | 6.25 |
| 乌梅 Fructus mume | 50.00 | 50.00 | 50.00 |
| 黄连 Coptis chinensis | - | 25.00 | - |
| 五味子 Schisandra chinensis | - | - | - |
| 蒲公英 Taraxacum mongolicum | - | - | - |
| 女贞子 Fructus Ligustri | - | - | - |
| 金银花 Lonicera japonica | - | - | - |
| 苏木 Caesalpinia sappan | - | - | - |
| 连翘 Forsythia suspensa | - | - | - |
| 紫花地丁 Viola philippica | - | - | - |
| 苦参 Sophora flavescens | - | - | - |
| 黄芪 Astragalus memeranaceus | - | - | - |
注： -表示质量浓度为100 mg/mL时，无抑菌效果。Note：- means that no antibacterial effect is observed when the concentration is 100 mg/mL.
大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌3种致病菌用0、1、2和4倍MIC浓度诃子药液处理后，培养液总漏出率、电导率和蛋白增量结果见
图1 大肠埃希菌（A、D、G）、肺炎克雷伯菌（B、E、H）和阴沟肠杆菌（C、F、I）经诃子药液处理后，培养液的总漏出率（A、B、C）、电导率（D、E、F）和蛋白增量（G、H、I）
Fig.1 The total leakage rate （A，B，C）， conductivity （D，E，F） and protein increment （G，H，I） of Escherichia coli（A，D，G）， Klebsiella pneumoniae（B，E，H） and Enterobacter cloacae（C，F，I） treated with Terminalia chebula
用不同质量浓度诃子药液处理后，3种致病菌大量离子外流，使得胞外离子浓度增大，光密度增加（
大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌分别用0、1、2和4倍MIC浓度诃子药液处理后，致病菌DNA的含量变化如
图2 大肠埃希菌（A）、肺炎克雷伯菌（B）和阴沟肠杆菌（C）用诃子药液处理0、2、4和6 h的DNA凝胶电泳图
Fig.2 DNA gel electrophoresis results of Escherichia coli（A）， Klebsiella pneumoniae（B） and Enterobacter cloacae（C） treated with Terminalia chebula for 0， 2， 4 and 6 h
用1倍MIC浓度诃子药液处理3种致病菌0、4和8 h的菌体蛋白含量变化如
图3 大肠埃希菌（A）、肺炎克雷伯菌（B）和阴沟肠杆菌（C）用0和1倍MIC浓度诃子药液处理0、4和8 h的蛋白SDS-PAGE图
Fig.3 SDS-PAGE of proteins of Escherichia coli（A）， Klebsiella pneumoniae（B） and Enterobacter cloacae（C） treated with Terminalia chebula in concentration of 0 and 1 MIC for 0， 4 and 8 h
M：Marker.
取3种致病菌DNA，分别用0、0.5、1、2和4倍MIC浓度诃子药液处理10 min后，DNA的凝胶阻滞结果见
图4 大肠埃希菌（A）、肺炎克雷伯菌（B）和阴沟肠杆菌（C）的DNA用0、0.5、1、2和4倍MIC浓度诃子药液处理10 min的DNA凝胶电泳图
Fig.4 DNA gel electrophorograms of Escherichia coli（A）， Klebsiella pneumoniae（B） and Enterobacter cloacae（C） treated with Terminalia chebula in concentration of 0， 0.5， 1， 2 and 4 MIC for 10 min
通常，某种中草药只对1种或少数几种致病菌有抑菌作用，如艾叶、黄芩对大肠埃希菌有抑菌效
细胞膜是细菌天然保护屏障，在维持细胞内环境稳定代谢和调节选择物质交换方面有重要作
DNA和蛋白在细菌增殖中保持相对稳定，而抑菌剂可以影响细菌DNA的合成、蛋白表达，或直接作用于DNA。本试验中用诃子处理后的3种致病菌，DNA浓度降低，细菌数量减少，表明诃子能抑制细菌的增殖，并具有杀菌效果。研究丁香酚和异丁香酚的抑菌机制时，发现丁香酚能破坏细胞壁、膜，细胞膜通透性改变，使其失去生命力，并且抑制部分蛋白合
凝胶阻滞作用可以反映药物是否与DNA直接作用，是探究药物作用机制的重要手段。本研究用诃子处理细菌DNA后，虽没有发现明显的阻滞作用，但DNA条带明显变暗，表明诃子能降解DNA，即诃子的抑菌机制之三，是通过抑制DNA合成和降解部分DNA发挥抑菌作用。
总之，诃子在体外可以通过多种机制抑菌，如破坏细菌细胞膜、改变核酸和蛋白的合成，具有良好体外抑菌效果，在畜禽呼吸系统和消化系统病原体疾病的防控中具有应用潜力，值得进行临床应用研究。
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